实验三3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖.docx

实验三 3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖
一、实验目的
1、掌握还原糖定量测定的原理和方法。
2、掌握分光光度计的使用方法。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖10257 RP麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,。
三、实验器材
1、实验仪器
1)恒温水浴锅
2)可见光分光光度计
3)电子天平
4)三角瓶(100ml)
5)容量瓶(100ml)
6)胶头滴管
7)移液管
2、实验材料
1)食用面粉
2)1 mg/ ml 葡萄糖标准液:准确称取 100mg 分析纯葡萄糖(预先在 8 0 ℃烘至恒重),置于小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,定量转移到 100ml 的容量瓶中,以馏水定容至刻度,摇匀,冰箱中保存备用。
3)3, 5- 二硝基水杨酸试剂:将 3, 5- 硝基水杨酸和 262ml 2mol/NaOH 溶液,加到 500ml 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠,搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至 1000ml ,贮于棕色瓶中备用。
4)碘-碘化钾溶液:称取 5g 碘和 10g 碘化钾,溶于 100 ml 蒸馏水中。
5)酚酞指示剂:称取 酚酞,溶于 250ml 70 %乙醇中。
6)6mol/L HCl 。
7)6mol/L NaOH 。
四、实验步骤
(一)制作葡萄糖标准曲线
取7支试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
管号
1mg/mL葡萄糖标准液
(mL)
蒸馏水
(mL)
DNS
(mL)
葡萄糖含量
(mg)
光密度值
(OD540nm)
0
0
2

0
1




 
2




 
3




 
4




5




 
6




将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5min,取出,冰浴冷却至室温,用蒸馏水定容至25mL,在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0号管调零点,测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,做出标准曲线。
(二)样品中还原糖和总糖含量的测定
1、样品中还原糖的提取:
准确称取 2g 食用面粉,放在 100m