过氧化氢的测定方法.doc

三、过氧化氢酶的活性----紫外吸收法[原理]H202在240nm波长下有强吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。[仪器与用具]紫外分光光度计;离心机;研钵;容量瓶250ml1个;;2ml1支;10ml试管3支;恒温水浴锅。[试剂]?L-(内含1%聚乙烯吡咯烷***);?L-1H202(?L-1高锰酸钾标定)。[方法],置研钵中,加入2-3ml4℃,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀,将量瓶置5℃冰箱中静置10min,-1下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液,5℃下保存备用。,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表42-2顺序加入试剂。25℃预热后,,每加完1管立即记时,并迅速倒入石英比色杯,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按式42-3计算酶活性。(u)。过氧化氢酶的活性(-1min-1)=式中Aso--加入煮死酶液的对照管吸光值;As1,As2-样品管吸光值;Vt--粗酶提取液总体积(ml);V1--测定用粗酶液体积(ml);FW--样品鲜重(g);-(u);t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。注意:凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。【思考题】1、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2、过氧化氢酶与哪些生化过程有关?参考文献【1】MukherjeeSP,(58):167-170【2】蒋明义,郭绍刚,(1):6-12【3】林植芳,,,14(1):16-22【4】:中国农业出版社,1995【5】【美】,:上海***,1982实验材料:小白菜注意事项:1、三角瓶、容量瓶等务必要清洗干净。2、研磨时CaCO3不要加得太多,大半匙即可,且要洒均匀。3、过滤时不必全部过滤完,有20ml滤液即可。4、把握好实验进度,不拖延时间,以免酶液失活。5、滴定时速度不要过快,以免过量(最快不要超过1秒/滴)。最佳终点为最后半滴加入后蓝色消失。6、每次滴定起点一致,都从零开始。7、左手操纵活塞,右手摇三角瓶,溶液要摇成漩涡状。8、为了保证实验的平行性,四个三角瓶里所加的试剂应该来自同组药品,中途不要试剂瓶(使用别组药品)。结果分析:但本实验的不确定因素很多,比