下载此文档

生化大实验指导书.docx


文档分类:行业资料 | 页数:约15页 举报非法文档有奖
1/15
下载提示
  • 1.该资料是网友上传的,本站提供全文预览,预览什么样,下载就什么样。
  • 2.下载该文档所得收入归上传者、原创者。
  • 3.下载的文档,不会出现我们的网址水印。
1/15 下载此文档
文档列表 文档介绍
生化大实验指导书.docx《生物化学大实验》参考资料《生物化学综合大实验》课程组2014年12月资料來源:1、张龙翔张庭芳李令媛.《牛化实验方法和技术》,1997年,笫2版;※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※孤※※※※※※※海实验一SDS聚丙烯酰***凝胶电泳蛋白质分子量的测定原理前已指岀,蛋白质在聚丙烯酰***凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。,如果在聚丙烯酰***凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS),则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的甌,①而与所带电荷和形状无关。在一定条件F,蛋白质的与电泳迁移率间的关系,可用下式表示:(1)lgMr=\gK—lm=Ki—bm (2)式中为蛋白质的相对分子质也K,K】为常数仏为斜率洌为迁移率。因此,要测定某个蛋白质的胚,只需比较它和一系列已知的蛋白质在SDS-凝胶电泳时的迁移率就可以了。,进“步证实了这个方法的可行性(见图3-31)。现在,经SDS-凝胶电泳研究过的蛋白质,已有很多种。用这种方法测定蛋白质的M八简便、快速,只需要廉价的设备和Pg越的蛋白质样品;所为结果,在M「为15000〜200000的范围内,与用其他方法测得的",相比,误差一般在±10%以内。因此,SDS•凝胶电泳测定Af的方法,已得到非常广泛的应用和迅速的发展。为了阐明SDS•凝胶电泳法测定蛋白质Mr的原理,许多人进行了深入的研究。实验证明•在蛋白质溶液中加入SDS和兢基乙醇后•蔬基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原£DS能使蛋白质的氢犍、蔬水键打开,并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下,。由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白质的SDS・复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。图331 37种蛋白质的对数对电沐迁移率图范围为11000-70000,10%軽胶,-S酸盐缓冲系统SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质・SDS复台物的渝体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状,近似干雪茄烟形的长梅圆棒,不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样,约为1-8nm,而长轴则随蛋白质的胚成正比地变化。这样的蛋白质-SDS复合物,在凝胶电泳中的迁移率•不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质M的函数。将蛋白质-SDS复合物在不同浓度的SDS•凝胶中电泳,-SDS复合物的上述性质。Ferguson公式:lg/w=lg加。—K”该公式原来是Ferguson提岀来描述蛋白质在淀粉凝胶中电泳行为的,后来证明它也同样适用于聚丙烯酰***凝胶电泳。式中刃是蛋白质在一定浓度凝胶(e)中的迁移率申。是当凝胶巡度外推到零时的迁移率即自由迁移率•它与蛋白质的净电荷蚩(0成正比,与蛋白质在溶液中的摩擦系数(/)成反比由溶液的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决定"Kr是阻滞系数(),它与蛋白质相对分子质量成线性关系。因此,不同的蛋白质分予有不同的加,叫和Kr值,几种蛋白质的Ferguson图见图3-32。而蛋白质-SDS复合物的Ferguson图则不同(见图3-33)«从图3-33可以清楚地看到,不同蛋白质的SDS复合物的叫值都很接近,胚相差5倍的蛋白质之间,叫值只相差10%,如果忽洛这个差别,就可以认为,各种蛋白质-SDS复合物的叫基本上是一个定值"这表明,不同蛋白质的SDS复合物都带有相同密度的负电荷,并具有同样的构象,因此,它们的净电荷量与摩擦系数之比(“C都接近于一个定值而不受各种蛋白质原来的电荷、分子大小和形状的影响,因而,在溶裁中,自由迁移率就表现岀-・致性;但在一定威度的凝胶中,由于引入了凝胶的分子筛效应•电泳迁移率m就成为蛋白质M的函数,根据以上事实,可以认为SDS■凝胶电泳测定蛋白质M,方法的基础是可靠的。当然,还有许图532几种蛋白质分子的电泳迁移率对凝胶浓度图5%交联度、-.*乳球蛋卵清蛋白,3・卵类粘蛋白,,,6・肌红蛋白,7-牛血清清蛋白一聚休,8・牛7--33儿种蛋白质-%交联度,,Tris-乙駿钠EDTA缓冲系统,L肌红蛋白(Mrl?200).2・胰卷乳蛋白誨原A(25000),(36000

生化大实验指导书 来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.

非法内容举报中心
文档信息
  • 页数15
  • 收藏数0 收藏
  • 顶次数0
  • 上传人小雄
  • 文件大小83 KB
  • 时间2020-01-04