RNAi抑制Survivin基因表达增加细胞凋亡.pdf

年月基础医学与临床
第卷第期. .
文章编号:... 研究论文
抑制基因表达增加细胞凋亡
薛芳,段明英,陈燕
济南市妇幼保健院妇产科,山东济南
摘要:目的构建表达载体,并检验其对基因的抑制效果,从而在细胞中研究基因的功能。方法
扩增小鼠肝组织中的启动子,并将其连接到载体中,构建带有启动子的载体,并构
建重组质粒和对照载体。将及分别转染入细胞中,经过稳定筛选细
胞,流式细胞术分析各组细胞周期及细胞凋亡率的影响因素,和细胞免疫荧光检测两组细胞—
蛋白质表达情况。/检测两组细胞/的活性。结果
细胞凋亡率,组明显高于组与对照组;细胞阻滞在/期.。在细胞中,
转染带有启动子的抑制基因表达的载体质粒,基因表达明显降低
.,其抑制率在% 以上。组/的活性明显增强.。结论构建的
载体能有效抑制基因的表达,/的活性明显增强。
关键词:干涉;;半胱氨酸蛋白酶/
中图分类号: 文献标志码:

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收稿日期:——修回日期:——
通信作者:;.
基础医学与临床.
干扰是由双链: 一,’
介导的、在转录后水平关闭相应基因表代℃一。
达的过程⋯。后来发现在很多动物和植物中都有退火反应体系为,内含×—
此现象,后被发展成为分子生物学研究的基因阻断,和
技术,并在人类基因功能研究和基因治疗方面显示各
出巨大的前景。基因是近年来发现的一/。混匀后加热至,缓慢降温
种细胞凋亡抑制基因,其高表达与宫颈癌细胞的高至℃,孵育,稀释倍用于连接反应。连接
耐药性密切相关。本研究构建了以作为启反应体系为,内含片段,
动子的抑制基因表达载体,从而研载体,×连接缓冲液,
究其抑制基因表达的效果。连接酶/ 。【下连接
,连接到载体多克隆位点与之
材料与方法
间。转化,提取质粒,测序鉴定为抑制
. 含有启动子载体的构建:达的载体。同时构建
.. 小鼠启动子的获得:取小鼠的肝组织, 阴性对照,载体。将上述目的序列改变个碱
常规方法提取组织,扩增启动子,上下基,经://.—
游引物设计时,分别引入酶切位点和,引..,//查询,没有与之同源的其他
物序列为:一基因,按照上述方法构建阴性对照载体,测序鉴
一;:一】℃一定。
。反应总体系为,内含基因组. 细胞培养,转染和稳定筛选
, 各为/,引物为./, 宫颈癌细胞株培养在中型培养瓶中,用
聚合酶。扩增条件为:℃变性, 含% 的新生牛血清、/青霉素、./
℃变,℃退火,延伸,进行链霉素的培养基培养,置℃、% 、
个循环扩增,然后再延伸。饱和湿度的条件下培养,细胞为贴壁生长,.%胰
.. 将启动子克隆到载体中:将上述酶消化传代。培养至细胞长至%密度,一半传至
, 小型培养瓶提取和蛋白质用,每瓶含有
按照说明书操作,转化大肠杆菌,提取质粒, .×细胞,一半传至孔板中的飞片上生长,
按照质粒提取试剂盒公司说明书操作。培养—后进行质粒转染。将上面构建的
用公司的型测序仪测序。载体用载体转染入细胞,