酶工程实验碱性磷酸酶实验报告.doc

猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要:碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内,是一种非特异性磷酸单酯酶。本实验材料取自猪肝,采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶,运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。根据酶活力变化,进行不同温度,PH对该酶的影响的实验,得出最适温度和最适PH。关键词:碱性磷酸酶;有机溶剂沉淀;酶活力;PH;温度1前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶,即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去,并生成磷酸根离子和自由的羟基,这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高,且其活性可在较长时间内得以保持。;酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算;了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。;匀浆器;紫外可见分光光度计;高速冷冻离心机;PH计;%乙醇、***、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G-250、硫酸镁、氢氧化钠(1)-:/L醋酸钠100mL,混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。(2)-硫酸镁缓冲液():称取三羟***氨基甲烷(Tris),用蒸馏水溶解,并稀释至1000mL,;,加蒸馏水约700mL,,混匀后用1%,用蒸馏水稀释至1000mL即可。(3)(4)(5)标准蛋白质溶液:称取10mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100mL,制成100ug/mL的原液。(6)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂:称取100mg考马斯亮蓝G-250。溶于50mL90%乙醇中,加入85%(m/v)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。;50mL离心管;烧杯;容量瓶;漏斗;量筒;玻璃棒;滤纸;移液枪(1000uL,100uL)等。,,置于玻璃匀浆器内,-,充分研磨至糊状。将匀浆液倒入刻度离心管中,记录其体积V1=45mL,,-醋酸镁缓冲液(),即50倍稀释,待测比活性用,为A液。加10mL正丁醇于匀浆原液中,用玻棒充分搅匀,然后放置冰浴中20min。用滤纸过滤,滤液置于另一支刻度离心管中。滤液中加入等体积的冷***,立即混匀后离心(8000r/min)5min,弃去上清液,,用