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SDS-PAGE 凝胶电泳 1 SDS-PAGE 凝胶电泳实验原理实验步骤注意事项 SDS-PAGE 的优点 SDS-PAGE 的缺点实验常见问题及处理小技巧 2实验原理?源起?基本原理?分类?分离范围?实验中各成分作用 3源起? 1967 年由 Shapiro 建立。? 1969 年由 Weber 和 Osborn 进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰***凝胶中加入离子去污剂( SDS )以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视. 4基本原理之一?阴离子去污剂 SDS 破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变其原有的构象,并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。?强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。 5基本原理之二?结合了 SDS 的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒,不同的蛋白质-SDS 复合物其椭圆棒的短轴长度恒定,而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。?这样的蛋白质-SDS 复合物在电场作用下,其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响, 而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点,就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。 6分类 PAGE 根据其有无浓缩效应,,缓冲液 pH 值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下, 主要靠电荷和分子筛效应。 78 电泳槽电泳槽 9不连续系统?不连续系统中由于缓冲液离子成分, pH , 凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 10