荧光定量PCR全攻略.pdf

荧光定量PCR完全攻略

1、什么是定量PCR?
以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中
靶基因的拷贝数,称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。
2、定量PCR定量的理论依据是什么?
特定的待扩增基因片段起始含量越大,则指数扩增过程越短,当扩增速率趋于稳定后,
则无论原来样品中起始模板含量多少,最终扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结
果:Y=X×2n 其中Y代表扩增产物量, X代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数; 理
论上PCR扩增效率为 100%,PCR产物随着循环的进行成指数增长,但实际上:DNA的每一
次复制都不完全,即每一次扩增中,模板不是呈 2 的倍增长;实际应为:Y= X(1+E)n ,其
中E 代表扩增效率:E = 参与复制的模板/总模板,通常E≤1,E在整个PCR扩增过程中不是
固定不变的。通常X 在 1~105 拷贝、循环次数n≤30 时,E 相对稳定,原始模板以相对固
定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n的增加(>30
次),E值逐渐减少,Y 呈非固定的指数形式增加,最后进入平台期。
3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么?
PCR 是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰PCR 指数扩增的因素都会影响扩
增产物的量,使得PCR 扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通
过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践,研究了
相对准确的定量 PCR 方法,即荧光定量 PCR。
n
PCR扩增通式: ① Tn=T0(1+E)
n
② Tn=Tn-1(1+E) 注:[0<E< 1]
其中E表示扩增效率,n为循环数,Tn表示在n个周期后PCR产物的数量,Tn-1表示在n-1 个周
期后PCR产物的数量,T0为原始模板数量。设定PCR到达指数扩增期时,产生一定的荧光(荧
光依赖于某一循环扩增产物的总量,即特定的拷贝数K,为常数,大约在 1010左右)高于背
CP
景为仪器所识别,此时的循环数为CP(crossing point),也就是K= T0(1+E) ,取对数即:
lg K=lg T0+CP*lg(1+E)
CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)
由于对一特定的PCR而言,E与K均为常数,故上式为循环数(CP)对原始模板拷贝数的对
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数(lg T0)一次方程,其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为- 1/lg(1+E),在横坐标上的截距为
lgk/lg(1+E),也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标
准曲线:

目前荧光定量 PCR 均采用外标定量
外标法定量PCR扩增效率的计算,由于标准曲线的斜率(Slope)为- 1/lg(1+E),可知
E=10-1/Slope-1 ,如从标准曲线中知道Slope=-,则可推知扩增效率E=101/3。337-1=,也有作
者将(1+E)直接视为扩增效率E,则E=10-1/Slope,求得的E值均在 1—2 之间,有时也有大于 2
的结果,如下图所示。另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分
n2 n3
析扩增效率的高低,例如系列 10 倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0E , N3=(10*N0)E ,在扩
n2-n3
增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同,即N2=N3,E =10,取对数得到
⊿nl gE=1, E=101/⊿n,E=2,⊿n=; E=,⊿n=。如图所示。







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4、定量 PCR 可以分成哪几类?
根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增,定量 PCR 可分为四种
方法:
①有限稀释法,即倍比稀释法:通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止,来设置已知
浓度的参照品;根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线,计算出待检
标本中原始模板的分子数;利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点 A、PCR 产物的
最低可检测极限须有重复性;B、对每个稀释度必须作多次 PCR ,一般先对模板