利用西瓜种子检测黄瓜绿斑驳花叶病毒.doc

利用西瓜种子检测黄瓜绿斑驳花叶病毒.doc利用西瓜种子检测黄瓜绿斑驳花叶病毒摘要:以疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)的西瓜植株上收取的种子为材料,提取总RNA为模板进行RT-PCR扩增,并对电泳后的目标条带进行回收测序,将测序结果提交genebank与已知序列比较,结果显示所扩增序列为CGMMV外壳蛋白(CP)基因中的一个片段,说明此方法可以成功检测出西瓜种子携带的CGMMV,可作为一种快速检测西瓜种子是否携带CGMMV的方法。关键词:西瓜种子;黄瓜绿斑驳花叶病毒;RT-PCR中国是世界西甜瓜第一生产大国,西甜瓜播种面积每年约230万hm2,主产区遍布全国20多个省、自治区、直辖市[llo并且自20世纪80年代中期以来,西甜瓜生产一直是我国许多地方农民经济收入增加的重要来源。CGMMV是烟草花叶病毒属葫芦科植物的重要病毒之一,对葫芦科作物生产造成严重威胁[2〜5]。2006年我国农业部(农业部公告第788号)已将该病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物。由于种子带毒是CGMMV传播的主要途径,而种子是农业生产中不可替代的生产资料。因此,加强西甜瓜种子的安全生产,建立健全种子病毒检测方法,杜绝带毒劣质种子上市,从源头控制CGMMV的扩散蔓延有重要意义。CGMMV的检测方法有多种且均较为成熟,各有各的优点,但以西瓜种子为检测材料还未见报道。本研究以从感染CGMMV的西瓜植株上采集的种子为试验材料,并应用优化的RT-PCR进行检测鉴定,最终能够扩增出与目标片段大小一致的条带,将目标条带进行回收测序,测序结果显示扩增出的片段是CGMMV外壳蛋白(CP)基因的一段序列。本试验为种子生产企业在CGMMV的诊断与快速检测提供了参考。,待果实成熟后采集该植株果实并取种用于CGMMV的检测。、TRIZ0L购自迈科为公司、Pmdl8-T、TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4DNA连接酶、D2000DNAMaker等购自天根公司;胶回收试剂盒购自OMEGA公司;M-mLV逆转录酶购自Invitrogen公司;琼脂糖为BIO-WEST公司生产;其余试剂为国产分析纯。-PCR使用白静等[6]设计的可成功检测南瓜果实CGMMV的引物,上游引物CGMMV-cpf:5'-ATGGC'GATCAC-3,,下游引物CGMMV-cpr:5'-CTAAGCTVFCGAGGTGGTAGC-3',-,加液氮研磨成粉,按TRIZ0L法提取总RNA。方法如下:液氮研磨西瓜种子或叶片至匀浆,加1mLTrizol,,加500UL***仿异戊醇剧烈震荡15s冰浴10min,室温12000r/min离心15min;取上清液入新离心管,加等体积***仿异戊醇混匀,重复2次;取上清液入新离心管,加500uL异丙醇,轻微混匀,室温放置10min,12000r/min离心10min(4°C);弃上清液,加入lmL80%乙醇(用DEPC水配制),混匀,室温7500r/min离心5min;弃上清液,1mL无水乙醇洗涤,7500r/min离心5m