考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.ppt

实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
:
掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋白质的原理和操作；了解分光光度法测定蛋白质的几种方法；进一步熟悉分光光度计的使用。
二、原理分光光度法测定蛋白质的几种方法
1、双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质能与铜离子结合形成紫红色络合物，540nm，1-10g/L。与蛋白质的相对分子量及氨基酸组成无关，快速，不受硫酸铵干扰。灵敏度低，需要样品量大；
2、Folin-酚试剂法（Lowry法）：在碱性条件下，蛋白质首先与铜离子形成紫红色络合物，该络合物以及Tyr，Trp残基还原Folin试剂，产生深蓝色。750nm，-3g/L或500nm，-。灵敏度高，需要样品量少；但干扰因素多，操作试剂配制麻烦，不同蛋白质之间差异大。
3、考马斯亮蓝染色法：在酸性环境下，棕红色的考马斯亮蓝与蛋白质通过疏水力相结合，蓝色化合物，595nm，颜色深浅与蛋白质含量成正比。 -1g/L，灵敏度高，需要样品量少，不同蛋白质之间差异大。
4、紫外分光光度法：280nm，不同蛋白质之间差异大
三、仪器
721分光光度计（使用前预热20min）；
移液管：
四、实验试剂
标准蛋白质溶液：；
染色液（考马斯亮蓝G－250溶液）：－250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％的磷酸100 mL ，蒸馏水定容到1000 mL ，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
待测蛋白质溶液
五. 实验操作
1、标准曲线(蛋白质含量为0～)的绘制:
利用1，2，3，4，5，6号试管数据绘制。1号试管调零。
2 、样品提取液中蛋白质浓度的测定
7，8好试管数据取平均值。
试管号
1
2
3
4
5