结直肠癌癌旁粘膜CpG岛异常甲基化研究.pdf

浙江大学
博士学位论文
结直肠癌癌旁粘膜CpG岛异常甲基化的研究
姓名:朱益民
申请学位级别:博士
专业:劳动卫生与环境卫生学
指导教师:来茂德
20040501
缩略语塑堡查堂堡主堂堡笙苎——第彻甈瓽籆一狟—狦’一猵
结直肠癌癌旁粘膜阂斐<谆难芯中文摘要级博士研究生来茂德教授研究背景朱益民导师多基因作用。随着肿瘤分子生物学研究的深入,发现越来越多的基因改变参与的两个重要方面,涉及遗传与表遗传的改变。遗传性改变是过去年肿瘤分系统恶性肿瘤。在西方发达国家居民恶性肿瘤死因顺位中结直肠癌位居第二,在我国恶性肿瘤死因顺位中居弧=昀次夜嶂背Π┓⒉÷驶旧呈现上升趋势,特别在城市以及发达农村地区,增速尤其以结肠癌更为明显。随着我国居民生活方式和饮食结构的改变,结直肠癌的危险性还会持续上升。因此结直肠癌发病机制以及防治策略的研究有十分重要意义。从正常细胞发展到肿瘤是一个漫长而复杂的过程,涉及多阶段、多步骤、到结直肠癌发生、发展过程,其中癌基因的活化和抑癌基因的失活是基因改变子生物学研究的基础。表遗传是一种由非蛄懈谋湟鸬模梢糯ǖ幕,是一种严重威胁人类健康的常见消化因表达水平的变化,包括谆⒆榈鞍椎囊阴;腿旧实墓剐透谋结直肠癌浙江大学博士学位论文本项目受国家自然科学基金资助,项目编号第彻
研究方法研究目的塑望筇枚橹魈帽けぼ肿瘤相关基因特别是抑癌基因研究的新途径。甲基化豪┰龇椒富集基因组内甲基化航ɑ蜃镈/连接,然后┰龊薪油返腄片段。外显子旱募谆牖虮泶镆种啤⒒蚬δ苋笔в泄亍P矶嘁职┗如瓻珺,韧ü鼶异常甲基化而失活。与正常细胞相比肿瘤细胞的基因组旱募谆刺嬖诓钛。因此从研充正常组织和癌的异常甲基化可能与肿瘤的发生、发展有关。目前谆难芯恳殉晌研究结直肠癌癌旁粘膜和正常结肠组织杭谆姆植疾钜欤治结直肠癌发生早期的异常杭谆谋洌剿鹘嶂背Π┓⑸讨屑谆酚/氯仿抽提纯化后,在用傅淖饔孟掠牒嗤扯说慕油代表性差异分析筛选差异的甲基化片段将癌旁粘膜的镉谐油罚匦滦纬烧衬┒耍⒂胄陆油啡鏙等。谆怯跋毂硪糯ɑ频闹饕R蛩兀虻’端启动子和第一组织差异的甲基化序列出发,可以寻找新的肿瘤相关职基固,这些基因化作用的碌肿瘤相关基因。对分离到的差异甲基化序列喙鼗颍甋基因在结直肠癌病人不同组织中的表达情况进行分析。用阅谇忻窼鸹詈笥猛衙竂酱蜗锞第彻:
盖谐油罚硬煌油有相同粘端械轮治与癌旁组织、正常组织甲基化富集后的产物和第轮镌咏弧基化序列相关基因诮嶂背Π┌┡哉衬ぁ⑾倭觥⑾侔┮约跋嘤υ抖饲数据统计分析用中位数和四分位间距:,~描述水平上相对表达水平;各组间在和蛋白水平上的表这比较采用配对的秩和检/等连接,以此作为检测子;用酶切除正常结肠组织的产物的接头,彤成平末端,以此作为驱赶子。将检测子和驱赶予按如此依次进行四轮治觥5~址治鏊玫慕油贩直鹞猂克隆、测序及相似性分析对第諶分析产物经克隆、测序后获得的序序列进行相似性分析,并通过阉鞣治隹寺⌒蛄杏胂喙鼗虻墓叵怠占、杂交分析采用随机引物法,以地高辛标记的差异甲基化片段为探针免疫组织化学法用免疫组织化学法检测鞍自诮嶂背Π┌┡哉衬ぁ⑾验窖網投嘌綟。的比例进行杂交,用绿豆核酸酶消化单链蟮牟镒魑D0褰┰觯竦貌钜旒谆疍。对第址治龌竦玫募谆钜炱卧儆/、/、/。列,采用分析系统进行重复序列分析,用低扯运獾半定量以谋泶镒魑D诙哉眨捎肦狿方法检测差异甲缘正常组织中的表达情况。瘤、腺癌以及相应远端切缘正常组织的表达情况。浙江人学博士学位论文第彻
塑垩查堂塑主兰垡笙奎研究结果结论新抑癌基因的发现提供一个很好的研究方法。这些差异片段的甲基经分析,获得个非重复序牟钜旒谆巍Mü鼴系统相似性分析,这些片段与相关基因的关系主要分为下面啵位于相关基因的嘶虻谝煌庀宰忧颍灿个序列符合这种分布。挥谙关基因的内含子或其它外显子区,有个序列属于这一类型。个序列在姓也坏较喙氐幕颉还有鲂蛄性诨蜃橹姓也坏接胫匹配的位置。差异甲基化片段与颉与在水平上,远端切缘正常结直肠组织谋泶锵灾哂谙嘤的癌旁粘膜、┡哉衬さ较侔㏒基因的表达呈降低趋势。免疫组化结果表明,┳=岢ψ橹┡哉衬さ较侔琒蛋白的表达呈现先高后低再升高的趋势,即“毙伪浠摺的差异甲基化危V琢龅燃膊〉脑糯芯咳鏒甲基化的作用、蛭恢孟喙亍运用岷蟁分析可以有效分离结肠癌癌旁粘膜与正常结肠组织化可能与相应碌基因的失活、结肠癌的发生有关。在水平上,与远端切缘正常结直肠组织相比,差异甲基化序列第彻
喙鼗蛞籗基因在结直肠癌癌旁粘膜、腺瘤、腺癌中低表达;在蛋白水平上,鞍自诎┡哉衬さ捅泶铩U庑┙峁砻鳎琒基固可能在结直肠癌的发生、发展中起作用,其作用性质类似于抑癌基因的特征。浙江大学博士学位论文第彻