细胞传代标准操作规程.docx

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细胞传代培养 SOP（消化法）
具体步骤如下：
传代前准备：
预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、 PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入 37℃水浴锅内预热。
用 75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
正确摆放使用的器械： 保证足够的操作空间， 不仅便于操作而且可减少
污染。
点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火， 8 分钟再次
消毒。
取出预热好的培养用液： 取出已经预热好的培养用液， 用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
从培养箱内取出细胞： 注意取出细胞时要旋紧瓶盖， 用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
胰蛋白酶 -EDTA消化：
加入消化液：小心吸出旧培养液，用 PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶 -EDTA液），注意消化液的量以盖住细胞最好， 最佳消化温度是 37℃。
显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
吸弃消化液加入培养液： 弃去胰蛋白酶液， 注意更换吸管， 加入新鲜的培养液。
吹打分散细胞：
吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10ml 离心管中。
平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中， 以 1000 转/ 分钟离心 6-8 分钟。
弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
分装稀释细胞：
分装：将细胞悬液吸出分装至 2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶
盖。
显微镜下观察细胞： 倒置显微镜下观察细胞量， 必要是计数。 注意密度
过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于 5×105/ml 。最后要做好标记。
5. 继续培养：
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2培养箱中继续培养。传代
细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积 25％时
1
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为一个＋，占 50％为＋＋，占 75％时为＋＋＋。
传代细胞培养注意