实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析.doc

实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析
相关基础知识
人外周血液中的小淋巴细胞,几乎都处在G1期(G0期),一般情况下是不再分裂的。在培养液中加入植物凝血素(PAH)时,小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞,随后进入有丝分裂。这样经过短期培养、秋水仙素的处理、低渗和固定,就可获得大量的有丝分裂细胞。目前本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等领域广泛采用。
人类每个体细胞有46条染色体,22对常染色体和一对性染色体,男子是46,XY;女子是46,XX。根据各组染色体的特征予以分组:A组:(N01~03)是最大的一组染色体,它们的着丝粒在中部或几乎在中部;B组(N04~05)为两对大的亚中着丝粒染色体,它们有显的长臂和短臂;C组(N06~12+X)为中等大小的亚中着丝粒染色体,它们大小相差不多,X染色体大小介于期间,一般难以区分;D组(N013~15)为中等大小的端着丝粒染色体,它们的一个重要形态特征是随体,随体是一对着色很深的小球,处于短臂的末断,随体与短臂之间的区域很少着色;E组(N016~18)包括一对中着丝粒染色体,亚中着丝粒染色体和一对近端着丝粒染色体;F组(N019~20)为两对小的中着丝粒;G组(N021~22+Y)为最小的一组端着丝粒染色体,在N021~22的短臂上可见随体,Y常呈现异固缩状态,着色更深,可以识别。
实验目的和要求
掌握人体微量血液体外培养技术和制备染色体标本的方法;
观察人类染色体的形态,并计数、配对、分类和绘图。
实验材料和仪器
实验材料和试剂
人的外周血淋巴细胞;
Giemsa母液:量取33ml甘油, Giemsa粉混合,研磨至无颗粒为止,再将剩余甘油倒入,搅拌后于
56oC水浴保温2小时,再加入33ml甲醇,搅拌均匀后储存于棕色瓶中;
Giemsa染色液: 。
实验仪器和设备
灭菌注射器(5ml)
离心管
无菌吸管
量筒
培养瓶
试剂瓶
其它:酒精灯,烧杯,天平,离心机,恒温培养箱,冰盒、载玻片、切片盒、光学显微镜等
实验方法和步骤
淋巴细胞培养与处理
培养液的分装:在无菌室内或接种罩内,用移液管将培养液和其他各试剂分装入10毫升培养瓶中,1640培养液4ml,小牛血清1ml,,,双抗(青霉素和链霉素,终浓度为100U/ml),%~。
取血:用5ml灭菌注射器吸取肝素(500 U/ml)。用碘酒和酒精消毒皮肤,,在酒精灯火焰旁,自橡皮塞向培养瓶内(内含有生长培养基5ml)接种,,轻轻摇动几次。
细胞培养:直立置37ºC±ºC恒温箱内培养,培养66~72h。
秋水仙素处理:培养终止前在培养物中加入浓度为40μg/~,~,置37ºC±ºC恒温箱中处理2~4h。
低渗处理:低渗液的种类较多,,%的枸橼酸钠溶液,用蒸馏水稀释4倍的
Hanks液,也可直接