一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂纯化及特性.pdf

摘要蛋白酶抑制剂琍是一类对蛋白酶活性有抑制作用的蛋白质。这类蛋白质普遍存在于动物、植物和微生物中,是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一。根据它们作用于酶的类型,分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中,因丝氨酸蛋白酶抑制剂分布广泛,种类繁多,在蛋白质一级结构、作用机理、氨基酸组成以及生物活性等方面有较为深入的研究。胰蛋白酶抑制剂琓泛指具有抑制胰蛋白酶活性的一类物质,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。分子量一般比较小,作用机制清楚,是研究蛋白质构效关系的合适材料。人们对来自大豆、豇豆、水稻、马铃薯等植物中的胰蛋白酶抑制剂研究得较为广泛,对荞麦胰蛋白酶抑制剂珺难芯吭虮冉仙佟荞麦;.谑澜缟弦恍┕液透吆区都有种植,在某些地区还被作为主要粮食作物。由于其风味独特,籽实中的蛋白质含量高,含有多科,氨基酸,营养丰富,尤其是保健和药用功能显著,日益受到人们的关注。但也有报道表明荞麦食品在人体和动物中不易吸收,较难消化。对其内在成分分析发现,蛋白酶抑制剂作为一种抗营养因子,可以抑制蛋白酶的活性,从而限制了体内氨基酸的正常吸收和利用。另外在体外研究发现,苦荞胰蛋白酶抑制剂能够显著抑制一白血病细胞的增殖,而对正常细胞毒性较小。由以上研究可以发现,且恢种匾5挠泄δ艿幕钚缘鞍祝徊窖芯科淅砘灾史我们先前的研究表明荞麦籽实中的含量较少,经分离纯化后的产量难以满足研究及应用。为了开展南低逞芯坎⒔沂酒渥饔玫幕恚本实验将已构建的重组质粒诖蟪Ω司鶰中大量表达,获得了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂>缀筒阄龊湍汗瞬阄龃炕玫礁叽慷鹊膔Mü砘性质分析表明,重组养麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的性质类似。用甌—分析测出的相对分子质量为常重要。
,等电聚焦电泳表明的等电点约为,分子中含有较多的酸性氨基酸。对牛胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制摩尔比訠为底物猯:。抑制动力学分析表明胍鹊鞍酌傅淖饔梦7蔷争性抑制作用类型。另外,的最适值为,在之间有较好的热稳定性,婕尤员3サ囊鹊鞍酌敢种活性。为了确定分子的活性位点,作者在已经获得抑制剂基因的基础上,利用重组ǖ阌毡浞ǘ詒蚪辛送槐洌ǖ鞍仔蛄兄的珹突变成甐,构建了突变体,并在甤菌株中获得稳定表达。对突变体进行纯化和胰蛋白酶抑制活性分析,结果显示突变体失去了%的抑制活性,表明瓵。。可能位于抑制剂通过本实验我们得出以下结论:且恢址肿恿拷闲〉牡鞍质,对热和酸有较好的稳定性;げ獾陌被嶙槌杀砻鳎瑀κ于荞麦抑制剂中的永久性抑制剂;耘R蛋白酶有较强的抑制作用,根据抑制摩尔比及抑制动力学结果推测,与胰蛋白酶的作用为非竞争性抑制作用类型;肿又械瓵可能是幕钚灾行那颍肜醋源蠖怪械腜嗨疲粲丝氨酸蛋白酶抑制剂中的马铃薯抑制剂易本实验结果为进一步研究抑制胰蛋白酶的作用机理、提高养麦蛋白质吸收率以及研究共⒖钩婕捌渥魑Q笾械目褂Q蜃拥作用机理等奠定了基础,也为基因工程药物的开发提供了重要的理论依关键词:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂:纯化;性质:定点突变;活性位点的活性中心。据。.
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第一章文献综述鞍酌敢种萍粮攀蛋白酶抑制剂的类型蛋白酶抑制剂琍是一类对蛋白酶活性有抑制作用的蛋白种类之一。蛋白酶抑制剂能与蛋白酶的活性部位结合,抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为有活性的酶,在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面起着重要的作用,在一系列的生理病理过程中也起着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成部分。蛋白酶抑制剂在植物中分布甚广,在许多农作物如小麦、大麦、玉米、豆已被分离纯化。根据同源性,已测定了氨基酸序列或峁沟闹参锏鞍酌敢种萍迄今为止,自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂,根据所抑制的酶的活性基团不腚装彼岬鞍酌敢种萍用方式、抑制作用机理、饩逖苌渫计住⑸砉δ堋⒔揪兜确矫娑加懈O根据不同抑制剂之间的序列同源性、抑制剂分子中二硫键的含量及作用方式等,根据分子所含活性位点的数目,又可将其分为单头抑制剂猦和多头抑制剂。多头抑制剂有两种形式,一种是由各含一个活性位点的多条肽链通过非共价键形成的多聚体,如质。这类蛋白质普遍存在于动物、植物和微生物中【,是自然界含量最为丰富的蛋白类、番茄和马铃薯中均有存在,多见于种子和块茎内。在植物贮藏器官中,含量通常高达总蛋白的%口V