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湖南农业大学课程论文学院:动物医学院班级:专硕动医班姓名:吕轩学号: SZ20150643 课程论文题目:犬瘟热诊断技术的研究进展评阅成绩: 评阅意见: 成绩评定教师签名: 日期: 2015 年 12月 17日犬瘟热诊断技术的研究进展学生:吕轩动物医学院摘要: 近年来, 犬瘟热已严重危害了犬及毛皮动物养殖业的健康发展, 快速、准确的诊断技术对于犬瘟热的预防显得尤为重要。现阶段犬瘟热诊断技术的研究主要有病毒分离培养与镜检观察、酶联免疫吸附试验( ELISA )、免疫组化、免疫胶体金、核酸杂交、巢式 RT - PCR 、实时荧光定量 RT - PCR 、双重 PCR 、基因芯片、液相芯片、环介导等温扩增等。获得能产生典型细胞病变的易感细胞株是成功进行犬瘟热病毒分离培养与镜检观察的关键。作者就犬瘟热诊断技术的研究进展作一综述, 为有效预防和控制犬瘟热的流行和暴发提供简便、高效的检测技术。关键词: 犬瘟热; 诊断技术; 研究进展犬瘟热由犬瘟热病毒( canine distem p er virus , CDV ) 感染所致, 该病呈世界性分布,对宠物犬和经济毛皮动物(貂、狐、貉) 等危害严重, 死亡率可达80%~90% ,1997 年的《中华人民共和国动物防疫法》将其列为三类动物疫病。近年来, 人们对犬瘟热病的研究虽取得很大进展, 但由于该病在感染后多继发细菌性、病毒性感染, 早期诊断困难, 且动物一旦发病死亡率高。因此, 做好预防及建立早期快速而准确的检测方法, 对控制犬瘟热的流行意义重大。作者就目前国内外对犬瘟热诊断技术的研究进展进行综述, 以期为该病的防控及快速诊断技术研究提供参考。 1 病原及流行特点 CDV 为副黏病毒科、麻疹病毒属成员, 是有囊膜的单股负链 RNA 病毒,囊膜上的附着蛋白( at - 收稿日期: 2014 - 12 - 29基金项目:吉林省重点科技攻关项目(20130206039N Y )作者简介:苏凤艳( 1973 - ),女,吉林集安人,博士,研究方向:经济动物疾病防治,E - mail : sufy110@ * 通信作者:王全凯( 1958 - ),男,吉林松原人,博士,教授,博士生导师,研究方向:经济动物疾病防治,E - mail : **********@ 5 期苏凤艳等:犬瘟热诊断技术的研究进展 1319 tachment p rotein or hema gg lutinin p rotein ,H )和融合蛋白( fusion p rotein ,F ) 在病毒吸附和侵入宿主细胞过程中起着重要作用。在 CDV 免疫学研究中,因H 和F 蛋白具有许多病毒中和性抗原表位, 可诱导机体产生中和抗体, 常作为合成疫苗和基因工程亚单位疫苗的研究对象[1 - 2] 。一般常用非洲绿猴肾细胞系( Vero ) 和犬肾细胞系( MDCK ) 进行 CDV 的分离培养、增殖、病变观察、疾病的诊断及疫苗的开发等研究[3 -5]。目前大多数毛皮动物养殖国均有该病的流行,已成为危害毛皮动物的三大主要传染病( 犬瘟热、病毒性肠炎、阿留申) 之一。一般冬春季多发, 幼畜最易感, 典型病例表现为体温升高且呈双相热型。但随着养殖业的发展,大范围易感动物的运输导致 CDV 的发病规律不再具有季节性、周期性和地域性。 2 病毒分离培养与镜检观察 CDV 的成功分离是进行病原学诊断的基础,也是确诊该病最可靠的方法, 但分离率往往较低, 这是由于用于 CDV 分离的细胞一般不表达 CDV 受体[6 -7]。国内外试验结果表明, 稳定表达CDV 信号淋巴激活分子(SLAM ) 受体的细胞株, 能有效分离 CDV , 并且不受传代次数限制, 产生比传代细胞更明显的细胞病变( CPE )。因此,为了提高 CDV 的分离率, 需对分离 CDV 的常规细胞进行改造。创建稳定表达CDV -SLAM 受体细胞株的一般方法为: 采用分子克隆技术扩增 SLAM 基因, 构建 SLAM 真核重组表达质粒, 并将其转染于拟改造细胞,经 G418 压力筛选、单细胞克隆化、免疫荧光试验、 RT - PCR 、 Western blotin g 等筛选出稳定表达 SLAM 的阳性细胞。将 CDV 接种于阳性细胞和亲本细胞观察 CPE 情况, 判定阳性细胞的敏感度。依据上述方法, NaKano 等[8]成功建立稳定表达 SLAM 的犬肾细胞和猫肾细胞, 为犬瘟热病毒学和血清学分析奠定基础。赵建军等[9]建立的 Vero - rSLAM 细胞系接种 CDV 样品 36~48h 即可产生典型 CDV 致细胞融合病变, 分离的 CDV 保持较强毒力。朱颖等[10] 建立了能稳定表达 CDV 细胞受体 SLAM 的 BHK - 21 / SLAM 细胞系,感染 CD