毕业论文 小干扰RNA靶向递送方法研究.docx

毕业论文 小干扰RNA靶向递送方法研究.docx基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究
摘要
RNA干扰作为一种治疗途径尤其是恶性肿瘤的治疗具有巨大潜力。然而，系 统递送siRNA需要高效和生物相容性的递送手段。肿瘤细胞通过过度表达清道夫 B型1受体类（SR-B1）受体以清除HDL（HDL）粒子来维持其高生长水平。本文利用 这种细胞特性来实现高效siRNA递送，通过siRNA偶联重组成HDL（rHDL）纳米粒 子建立一种新型的siRNA制剂。这里，我们证实rHDL纳米粒子促进了siRNA体内 高效递送。此外，概念证明治疗研究中，这些纳米粒可以有效沉默两种蛋白的表 达，在原位卵巢和结肠直肠癌小鼠模型中，这两种蛋白是癌症生长和转移的关键 （信号传感器和转录激活因子3以及粘着斑激酶）。这些数据表明，rHDL纳米粒是 一种新型、高效的siRNA载体，因此。这种新型技术可以作为新型癌症治疗方法 的基础。
介绍
RNA干扰（RNAi）逐渐被认为是一种潜在，高效的治疗途径。这个概念根 源于干扰RNA （例如，小分子干扰RNA）基因沉默的能力，传统治疗方法很难 靶向这些基因，如抗体或小分子抑制剂。即使干扰RNA靶向特定基因确实很有 前景的，但需要体内高效和生物相容性的siRNA递送手段来实现其完整的治疗潜 力。虽然一些使用脂质体或其它纳米粒子的跨膜转运方法也已经报道，但是因毒 性和其他因素其治疗应用受到限制。因此，需要新型，更具有特定性的方法以系 统递送siRNA。
脂蛋白，尤其是HDL ,是脂质运输系统的必要成分。HDL在胆固醇逆转 中起着举足轻重的作用，通过促进外周细胞多余胆固醇返回到肝脏进行消除（胆 汁排泄或在肝肠循环使用）。关于内源性，HDL纳米粒是完全可生物降解的，并 且也无引起免疫反应的相关报道。此外，众所周知，HDL纳米粒可以逃避网状内 皮系统的吸收，比大多数药物制剂或其他脂蛋白，他们在循环中表现出更长的滞
留时间。HDL纳米粒循环的核心部分就是摄取，通过清道夫受体B类1型 （SR-B1 ）受体介导的机制，这种受体主要表达在肝脏和恶性肿瘤细胞。基于 体积小，屏蔽疏水核心，受体介导的摄取能力等这些有效特征，HDL纳米粒是一 种理想的药物载体。重组HDL是由人的HDL合成得到的。该rHDL纳米粒的组成 部分有磷脂酰胆碱，载脂蛋白A -1 ,胆固醇和胆街醇酯（图1A）。rHDL纳米粒 都很小，直径约12至18纳米。
为了研究siRNA靶向输送途径，一些肿瘤细胞受体已被获知。SR-B1受体主 要在肝脏中的表达，也在肾上腺或正常卵巢组织也较小程度表达。然而，在恶性 肿瘤细胞中SR - B1非常显著表达。增加HDL摄取可使肿瘤细胞产生较高增殖率。 例如，乳腺癌细胞通过增加SR-B1的表达来增加胆固醇酯的摄取。因此，考虑到 SR- B1在HDL中的作用，我们认为rHDL纳米粒可以作为选择性输送的有效载体。
siRNA基因沉默治疗非常有效，其他方法很难靶向这些基因。信号传感器和 转录激活因子3 [ STAT3 ]都可以介导正常细胞对多种细胞因子和生长因子的反 应。激活STAT3是恶性肿瘤转化和发展（例如，细胞增殖，分化和存活）的关 键过程。虽然STAT3可以在许多实体瘤里激活，但是它在正常组织中表达，并且 参与许多正常细胞过程。因此，使用小分子抑制剂或其他非特异性靶向STAT3的 手段可能会导致许多不必要的副作用，因此需要有效途径限制毒性。同样，粘着 斑激酶（FAK ）对于肿瘤细胞存活，转移，入侵也非常重要。在卵巢癌患者中， FAK过度表达与侵袭性肿瘤的特征相关，这有助于弱势细胞生存。概念证明，我 们在卵巢癌和大肠癌模型中证实使用r HDL纳米粒靶向STAT3和FAK治疗有效 性。
原料与方法
rHDL纳米粒的制备和siRNA的偶联
siRNA偶联到rHDL纳米粒，并储存在-20° C。简单地说，载脂蛋白A-I , 是rHDL纳米粒的主要核蛋白，在生产蛋白过程中用质粒载体进行分离和纯化。 然后，脂类混合物（胆固醇[C ] /胆固醇油酸[CE ] /蛋黄卵磷脂[PC],摩尔比的 1:5::115 ）在氮气流中干燥。5mg的siRNA用25 U g低聚赖氨酸（平均分子量
为500-2000 ）在30°。预先孵育30分钟，然后加入到脂质成分中。低聚赖氨酸/ siRNA混合物偶联脂质，分散在60 U （10mM Tris, KC1, ImMpH EDTA）。胆酸钠，140uL （ 100mg/ml 溶于为 PBS ）形成的蛋黄卵磷脂摩和胆酸的摩尔比为1:。载脂蛋白A-1（ ） ，终体积用PBS调整到2ml。4 °C孵育12h,接 着用2L