纤维素酶的定向进化、定点诱变及耐碱机理研究硕士论文.pdf

山东大学
硕士学位论文
纤维素酶的定向进化、定点诱变及耐碱机理研究
姓名:张洪喜
申请学位级别:硕士
专业:发酵工程
指导教师:刘相梅
20070416
摘要氨基酸残基进行定点突变。第籱槐湮狧和位由槐湮狦,近年来,纤维素酶在制浆造纸、;这些应用一般要求在中性或碱性条件下进行,因此碱性或耐碱性纤维素酶的研究逐渐受到重视。本课题组已经从碱性土样中筛选获得一株耐碱性纤维素酶生产菌株一枯草芽孢杆菌,并将其纤维素酶基因克隆盈质粒上构建重组质粒,在大肠杆菌谢竦帽泶铩1泶锏南宋孛窩与原始菌株产生的酶一样在甇≮.盋酶活力最高,这显然不能满足造纸、纺织、洗涤剂等行业的生产要求。为了适应工业应用的要求,本研究采用体外定向进化和定点诱变的方法对纤维素酶进行分子改造,以期获得碱性条件下酶活提高的耐碱性突变株。本文采用易错际鹾椭峦槐渚昙际酰⒘讼宋孛竿槐涮逦目狻J褂盟层平板检测法和液体酶活验证法对突变体库进行筛选,一共筛选了鐾槐涮澹有筛到碱性酶活提高的突变体,。测序结果显示,纤维素酶第坏陌被嵊蒊变为⑶曳⑸罩雇槐湓成荒┒⒚狢6悦富钚灾式行测定发现,酶活力有少量提高,性质基本没有变化,⑾缓位的氨基酸残基具有高度的保守性,所有碱性纤维素酶在欢际荋,酸性酶都是位碱性纤维素酶都是,酸性酶都是相应位置的氨基酸分别是虷。这种在特定位置高度保守的氨基酸残基很可能对酶的结构与功能起重要作用,尤其与该酶的耐碱性有关。为了研究纤维素酶的耐碱性机理,,结果发现最适...,碱性条件下酶活提高;;
通过同源模建,用甿艮务器构建了重组纤维素酶和各种突变的纤维素酶的三维结构立体图。通过对酶分子结构的分析,检测突变位点氨基酸残基对整个酶分子造成的影响,进一步比较突变位点氨基酸残基的侧链原子与催化残基的羧基氧原子之间的距离变化以及两催化残基之间的距离变化,从活性中心氨基酸残基的带电性能、空间位阻、与催化残基形成的氢键网络的变化等几个方面推测纤维素酶的耐碱机本文的研究工作,一方面可为从理论上探讨酶的结构与功能的关系,为酶的耐碱机理研究积累实验数据;另一方面为采用定向进化的方法获得酶的活性和耐碱稳定性提高的突变体,构建高效表达基因工程菌用于工业大生产奠定基础。关键词:碱性纤维素酶,定向进化,定点突变,耐碱机理制。山东大学硕士学位论文
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论文作者签名:狴杰重导师签名:恤日日期:碑论文作者签名:型酲墓期:堡骸唬骸原创性声明关于学位论文使用授权的声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅:本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。C苈畚脑诮饷芎笥ψ袷卮斯娑
第一章绪论引言地球上每年光合作用生成的全部绿色植物成分中,纤维素占了全部干重的,半纤维素约占/宋亍胂宋厥亲匀唤缱罘岣坏目稍偕茉次镏剩哂巨大的应用潜力。利用这一年产量巨大的可再生性资源将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会的可持续性发展具有非常重要的意义。尽管人类很早就开始利用纤维素,但是直到本世纪,随着纤维素酶的分离并确认以及环境危机、能源危机的日趋恶化,人们才意识到将这种丰富的可再生资源充分加以利用所潜在的巨大经济价值和环境价值。但是,传统的化学方法转化及降解纤维素、半纤维素会对环境造成极大的污染,因此,利用微生物产生的纤维素酶和半纤维