qPCR操作步骤.doc

qPCR操作步骤
qPCR操作步骤
qPCR操作步骤
具体的操作步骤就是,RNA提取,随机引物反转录,反转录产物10倍稀释,real-time PCR、这个就是标准的两步法。一步法就是把反转录与扩增联合起来做,不推荐使用。
具体。
3)加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次),-20℃静置15min;
4)4℃下,14,000g离心15min,收集RNA沉淀,去上清;
5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;
6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
四、总RNA纯度与完整性检测
1)纯度检测:取1μl RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1、8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。
qPCR操作步骤
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2)总RNA完整性检测:取RNA样品1μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min,EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA的5s rRNA, 18s rRNA与28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
五、逆转录
1、 mRNA:
1) 在RNase free的PCR管中配置下列溶液、
Total RNA 
H2O
1、0
µg
µl
总体积
12
µl
2) 将上述溶液吹打均匀,置85℃保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷, 以防止RNA复性;
3) 在该PCR管中加入下列试剂(Promega)
oligo(dT)
Random primer 
10mM dNTP 
RNase inhibitor 
5 x buffer 
M-MLV
0、5
0、5
2、0
0、5
4、0
0、5
µl
µl
µl
µl
µl
µl
总体积
8、0
µl
4) 将上述20μl反应溶液30℃保温10min;
5) 42℃保温50min;
6) 85℃保温10min;
7) -20℃保存。
2、 microRNA:
使用茎环逆转录法,原理如下图:
1) 在去RNase的PCR管中配置以下溶液、
total RNA
X个miR逆转录引物
H2O
1、0
0、5*X
µg
µl
总体积
12、5
µl
2)将上述溶液混匀,85℃孵育5min,以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构;
3) 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液:
qPCR操作步骤
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10mM dNTP (promega) 
RNase inhibitor (promega)
U6逆转录引物
5x buffer 
M-MLV (promega)
2、0
0、5
0、5
4、0
0、5
µl
µl
µl
µl
µl
总体积
7、5
µl
4) 将3)溶液加入到1)溶液中,混匀后30℃保温10min;
5) 42℃孵育50min;
6) 85℃孵育10min灭活逆转录酶。
四、定量PCR检测
1、引物测试:
根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性与扩增