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关于WesternBlot实验的一些小细节和小知识(一)很多客户购买试剂的时候询问做蛋白质电泳后染色考马斯亮蓝是用G250还是R250,他们的区别怎样。现将二者的区别贴在下面,方便大家的选择使用。R250中的R代表Red,偏红,属于慢染,脱色脱的完全,主要用于电泳染色R250(CoomassiebrilliantblueR250).C45H44O7H3S2Na,MW=824,λmax=560―,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,,偏绿,属于快染,脱色脱的不彻底,***.MW=854;λmax=590―,***乙酸中不溶而成胶体,,:G250主要用于蛋白测定;R250主要用于电泳染色我们在提取细胞蛋白的时候常常用100微升的裂解液裂解一个孔(六孔板)的细胞量,那么其他培养皿要加多少裂解液比较合适,附件里有各种常用细胞培养器皿的各指标参数。本人是根据面积来换算的。只做参考!不知道大家是不是常常会有这样的问题,显影液刚刚配置了不久就发黄不能使用了。如果是这样的话,很有可能是因为你的储存方法有问题。配制好的显影液是避光放置的(相信大家知道这点),而且配制好的显影液是不能和空气接触的,否则会很快发黄。我一般是一次配制1升的显影液,然后平均分为4份。把不用的3份装到容量小于250ml的棕色瓶中(盖盖子时刚好有多余的显影液溢出),封口胶封好再放置阴暗处。要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是WesternBlot。因为WesternBlot操作相对简单方便,既可以定*分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然,顺利的时候WesternBlot做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳*啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有活*的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定*的。所以,严谨的WesternBlot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就可以查出问题所在,而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小),空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照),已知量标准产物的正对照;另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因,国内的不少人做WesternBlot往往省略参照,导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。对比NP-40,TritonX-100,SDS三种去垢剂的裂解能力这三种去垢剂的作用是不同的,或者说作用力量强弱不同。SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。分离膜蛋白的方法和原理1、分离膜蛋白的方法(原则性):1)先分离膜,然后提取;如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎,然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。(例如:michael11液氮研磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分,即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白)2)用特殊的去污剂选择性的分离。,都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来,,但在某些情况下,,,但如果蛋白质是用于测序的,,,,,必须考虑某一