生物化学实验报告示范-3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线.doc

生物化学实验示范报告: 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线;马铃薯总糖含量测定实验二 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线马铃薯总糖含量测定实验目的 1. 熟悉并掌握 72 00 型分光光度仪的结构及工作原理和操作使用方法; 2. 掌握分光光度法测定物质含量的基本操作步骤及微机绘制标准曲线的操作方法; 3 .掌握 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖(葡萄糖)的原理及方法; 4 .掌握 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理与方法。实验原理 1. 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖(葡萄糖)的及标准曲线定制原理 3,5- 二硝基水杨酸在强碱溶液中与还原糖在沸水浴中加热反应后被还原成棕红色的氨基化合物, 该有色物质在 540nm 处有最大吸光度, 且在一定浓度范围内( 一般 OD 值在 ~ 范围内线性较好), 还原糖的量与反应液的颜色强度( 吸光度 OD 值) 呈线性关系, 利用分光光度仪, 以分析纯葡萄糖为还原糖测定的标准品,在 540nm 处按梯度依次测定各葡萄糖浓度对应的反应液的吸光度( OD 值) 大小, 通过微机处理数据,定制葡萄糖标准曲线,确定出 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖的线性回归方程; 2. 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理先将马铃薯去皮, 经机械粉碎, 过滤和清水漂洗, 烘干制成马铃薯淀粉; 再精确称取干燥恒重后的马铃薯淀粉加酸水解为还原糖,经中和定容,配制成马铃薯总糖含量测定的待测液(即样品液) ;再以标准曲线测定的加样操作方法, 测定出样品待测液的吸光度大小, 将测定的吸光度大小代入其回归方程, 即可计算出样品待测液的显色浓度, 根据稀释倍数关系, 计算出以还原糖的量表示的马铃薯总糖的量, 并测定出马铃薯总糖百分含量。该方法是半微量定糖法,操作简便,快速,杂质干扰较少。实验操作 1. 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线(1) 葡萄糖标准溶液的配制:( 2mg/ mL ) 准确称取 2000mg 分析纯的葡萄糖( 预先在 105 ℃干燥至恒重) ,用少量蒸馏水溶解后定容至 1000 mL ,冰箱保存备用(2 )葡萄糖标准曲线定制加样操作及测定结果纪录(详见表 1) 按表 1 进行实验操作, 在沸水浴中准确反应 20min , 取出后立即用冷水冷却, 加蒸馏水定容至 25mL , 摇匀,用 lcm 的比色杯于 540nm 处测光密度值。并记录 A 540 nm 处测得的各浓度及样品对应的 OD 值。(3 )葡萄糖标准曲线定制微机数据处理和回归方程(详见表 2 )及标准曲线的绘制见图 1 2. 马铃薯总糖含量测定操作(1 )马铃薯淀粉的制备(此处略,学生实验报告需补充完整) (2 )马铃薯淀粉水解待测液配制( 2mg/ mL ) 准确称取干燥恒重后的自制淀粉 250mg ,加入 100 mL 蒸馏水和 2 mL 20% 硫酸, 在沸水浴中加热水解, 直到水解彻底后,用 20% 氢氧化钠溶液中和,至 pH = ~ 后, 将反应液转入 250 mL 容量瓶中, 补加蒸馏水定容至 250 mL , 配制成浓度为 2mg/ mL 的淀粉水解后, 即总糖测定的样品液, 冰箱保存