定量聚合酶链反应QPCR测定技术.ppt

PCR?
PCR只是一个简单的不起眼玩艺
——凯利·穆利斯（Kary Mullis)
PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后
3’
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PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸
靶序列
靶序列
Primer 1
Primer 2
Biotin
Biotin
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq DNA
Polymerase
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第1个 PCR 循环完成后 –  得到两个拷贝的靶序列
靶序列
靶序列
Biotin
Biotin
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30次循环后靶序列扩增的数量
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1,048,576
30 1,073,741,824
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
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PCR扩增过程图示
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PCR扩增的理论模式
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n
0≤E≤1
其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。
等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.
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影响PCR扩增效率的因素: PCR定量的困难?
引物/靶的杂交
反应试剂的相对量
样本在扩增仪中的位置的不同
临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在
PCR扩增模板的量
靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低
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PCR 和定量问题
高浓度/高效率

高浓度/低效率

低浓度/高效率

N : 扩增分子的数目
n : 扩增循环的次数
log-phase analysis
N
n
end-point analysis
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定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别
定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期。
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定量PCR的方法
定量PCR方法可归为三大类，即外标方法、动力学方法和内标共扩增方法
定量还可分为绝对定量（即测定X的分子数量）和相对定量（即测定不同样本中X的比率）
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用外标准的定量PCR方法
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使用外标的定量PCR方法的优缺点
优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用双孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结果，甚至可排除管间的差异，但不能排除样本间的差异；
缺点：（1）PCR反应体系中小的区别也会对测定造成较大的影响。由于最后在扩增效率上的差异，从而使得定量测定精密度和重复性不佳。
因此，如果建立一个使用外标准的PCR定量方法，则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性。
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TaqMan实时荧光定量PCR
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分子信标实时荧光定量PCR
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动力学定量PCR方法
第一步：确定PCR扩增的效率；
第二步：根据相应的公式计算原始模板数。
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扩增效率的计算(1)
如果在PCR每一个扩增循环中扩增效率为常数，则可通过在PCR扩增的指数期的数个连续的或非连续的周