土壤溶菌酶提取的实验报告.docx

学术活动实验报告
题 目： 土壤中溶菌酶的筛选与发酵
指导老师：
小组成员：
时 期：
目录
摘 要……………………………………………………………… 1
一：实验目的 1
二：实验原理 1
什么是溶菌酶…………………璃棒、接种环、镊子、 恒温培养箱、高温灭菌 锅、无菌操作台、天平、滤纸、pH试纸等。
2. 试剂：
指示菌培养基:Luria-Bertani(LB)培养基，蛋白胨1%,酵母膏
%, NaCl 1%, pH 值调至 -,121°C灭菌 20min。
初筛培养基及菌株的保存培养基: 蛋白胨 1%，%，
NaCl 1%,琼脂 %-2%。pH 值调至 -,121°C灭菌 20min。
基础培养基：蛋白胨1%,%, NaCl 1%。pH值调至 -,121C灭菌 20min。
摇瓶发酵产酶培养基：可溶性淀粉 %,牛肉膏 %,玉米浆 1%, Tween %, pH 值调至 ,121C灭菌 20min。
土壤稀液：5g 土壤研磨，加10g无菌水，梯度稀释10-6倍。（梯 度稀释：取lml原液加入9 ml无菌水，反复五次，即为10-6倍）
实验步骤
步骤一：
土壤的稀释：
研磨土壤，量取5g 土壤加入锥形瓶中贴标签；
加入 50mL 的水用报纸封口；
土壤溶液放入恒温振荡器中震荡20分钟；
取5个试管，分别加入900吐的水；
从锥形瓶的土壤溶液中吸取100吐的溶液滴入第一个试管中， 反复吸放几次使溶液均匀；
换枪头从第一个试管中吸100吐的溶液至第二个试管中；
反复吸上吸下几次，使溶液均匀再换枪头吸100吐入第三个试 管中；
如此直至到第五个试管,然后给第五个管贴标签即为10 6的土壤 稀释液;
初筛培养基的配置（三组共作 200mL）：
取一个大锥形瓶，
中；
用小锥形瓶称量 牛肉膏；
在瓶中加入50 ml 水加热用玻璃棒搅拌溶解加入大锥形瓶中；
，加入50ml水摇匀后，再加
100ml 水，通过分两次加水避免出现球状不溶物；
配制NaOH溶液，用EP管不断向大锥形瓶滴加NaOH溶液同时用 ~,之所以要这 么做是因为实验室的水是弱酸性的；
，用报纸包扎封口，贴标签；
指示剂培养基的配置（三组共作 200mL）：
，
加入大锥形瓶中，
，加入50mL水摇匀；再加100mL的 水摇匀（多次分量加可以使物质溶解的更快）；
用滴液管吸NaOH溶液，搅拌测PH,~ （滴液 管保持竖直避免污染）；
称量琼脂 加入搅拌；
⑤加热同时搅拌，加热至溶解，用报纸包扎封口，贴标签；
高温灭菌：
⑴将两个培养基放入高温蒸汽箱中，120 °C灭菌约一个小时，其中 实际处于120 °C20min，先在锅底加水，放入培养基，盖上盖子， 关闭两个排气阀，设定好时间和温度后开始加热，冷却时先旋开侧 面排气阀再拨开上面的排气阀，待锅内相对气压降为零再开盖；
⑵打开无菌操作台的紫外灯，取出来培养液放入在无菌箱中稍等 约 10min ，然后趁热未凝固倒入培养皿中，以培养皿表面铺一层为 宜，贴标签；
⑶每组初筛和指示培养基各两个，3组共计12个，晾凉，待培养 液完全凝固后倒置在工作台中以待下一步处理；
土壤溶液的涂抹：
点燃酒精灯，用滴液管区第五支EP管中的土壤溶液200吐滴加 在培养基上；
用酒精浸湿涂抹棒后在酒精灯上烧烤消毒，打开培养基时用酒 精灯火焰烧一下开启处，用涂抹棒把培养皿盖上的水蒸气刮掉 作为冷却；
用涂抹棒将滴上去的土壤溶液做同心圆涂抹，直至培养及表面 无液体流动，抹得过程不要太用力以免刮破培养基，如果刮破 了就绕开破损处,这个过程很慢，要有耐心；
按以上步骤涂抹另外三个培养基；
完成后翻过来放入生化培养箱中进行培养1~2天，培养箱温度 为37 °C左右。
按1***：lg玉米配置一些玉米浆备用。 步骤二：
活性检测： 将培养基取出，可以看到指示培养基上长出不少一点点的金黄 色菌落这就是金黄色葡萄球菌的菌落，初筛培养基上长出成斑片状 白色的菌落这是能分泌溶菌酶的菌落。
找出菌落长得比较好的三组；将初筛①的菌接种到指示菌②的 金黄色菌落周围；再取一些指示②的金黄色葡球菌接种到初筛②上 面菌落周围。
接种时先把接种环浸酒精