白花蛇舌草对宫颈癌Hela细胞周期、凋亡及端粒酶活性的影响.doc

1 白花蛇舌草对宫颈癌 Hela 细胞周期、凋亡及端粒酶活性的影响作者:高超,刘颖,蔡晓敏,郝兴芝【摘要】目的研究中药白花蛇舌草( Hedyotic diffusa , HD )对人宫颈癌 Hela 细胞端粒酶活性、细胞周期及凋亡的影响, 以探讨 HD 抑制 Hela 细胞肿瘤活性与端粒酶的关系。方法分别以不同的药物浓度作用于体外培养的 Hel a 细胞,用 PCR-TRAP-ELIS A 方法定量检测HD处理 Hel a 细胞后其端粒酶活性水平, 同步采用流式细胞仪检测细胞周期的变化及凋亡率。结果 Hela 细胞端粒酶呈阳性,一定浓度的 HD 作用于 Hela 细胞一定时间后可使 Hela 细胞阻滞于 S 期,并可诱导其凋亡,而端粒酶活性明显降低。结论 HD 可能通过改变 Hela 细胞周期分布(S 期阻滞) 并同时诱导细胞凋亡,下调其端粒酶活性而达到抗肿瘤作用。【关键词】白花蛇舌草;宫颈癌 Hela 细胞;细胞周期; 凋亡;端粒酶 2 近年来一些学者对白花蛇舌草( Hedyotic diffusa , HD ) 的抗肿瘤作用进行了研究,其抗肿瘤作用基本得以肯定[ 1-4 ], 但对其作用机制尤其是分子生物学机制认识不深入。端粒酶的表达和细胞凋亡在肿瘤的发生和发展中起重要的作用, 如何诱导肿瘤细胞凋亡和调节端粒酶的活性已成为肿瘤治疗的一条新途径。 HD 具有明显的体内外抗肿瘤作用, 这种作用是否与引起肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞和端粒酶活性抑制有关, 目前文献报道不多。本研究以人宫颈癌 Hela 细胞为研究对象,用 PCR 产物的聚丙烯酰胺电泳及银染定性检测端粒酶活性, PCR-TRAP-ELISA 方法定量检测 HD 处理 Hela 细胞后其端粒酶活性水平变化, 同步采用流式细胞仪检测细胞周期的变化及凋亡率,以探讨 HD 抗肿瘤作用机制。 1 材料和方法 材料 Hela 细胞培养 Hela 细胞由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供, 培养液为含 10% 胎牛血清、 100 × 103 U/L 青霉素、 g/L 3 链霉素的 RPMI 1640 ,用 100 ml 培养瓶,置 5%CO2 、 37℃、饱和湿度的恒温箱中培养, 细胞达 80% ~ 90% 融合状态时用 % 胰蛋白酶消化后传代。实验期间不断冻存, 全部实验均用指数生长期细胞。 试剂胎牛血清( 天津血液研究所), 胰蛋白酶、核糖核酸酶(RNase) 、碘化丙啶( PI)、 PCR-TRAP-ELISA 端粒酶活性检测试剂盒均购自华美生物工程公司。 药物 HD( 江西天师中药集团余江制药厂)200 g 加蒸馏水 2 000 ml 温火煎煮 60 min , 加热沸腾 30 min , 网筛过滤去渣, 滤液离心 20 min , 取上清液浓缩为 200 ml, m 过滤除菌, 获1 kg/LHD 提取液备用。 实验方法 药物处理 4 % 胰酶消化后,用 RPMI 164 0 培养液调细胞密度为 1× 108 个/L ,每培养瓶各加 1 ml ,再各加入培养液 6 ml,置 5% CO2 、 37℃恒温培养箱中培养,待细胞生长达 70% 融合时更换培养液同时加入 HD 提取液, 使药物终浓度为 20、 40、 80 g/L ,不同浓度培养相同时间。设加入等量培养液者为实验对照组。 流式细胞仪(FCM) 分析 Hela 细胞周期和凋亡收集上述处理后的包括贴壁和悬浮的 Hela 细胞, 用 PBS 调细胞密度为 1× 109 个/L ,取 1 ml 单细胞悬液,离心、漂洗, 70% 乙醇 1 ml 固定细胞, 再用 PBS 漂洗, 在单细胞样本中加入 RNase , 再加入终浓度为 50 g/L 的 PI 染色, 过滤后用 FCM 测定。以正常人的外周血淋巴细胞为正常二倍体标准,根据测定的 DNA 组方图,用 CELLQUEST 分析软件分析 Hela 细胞的细胞周期和凋亡指数。 端粒酶活性检测 Bradford 法测定细胞提取液蛋白浓度制作 Bradford 法蛋白含量与光密度的标准曲线,根据 5 波长 595 nm 下所测样品光密度( D) ,从标准蛋白曲线上读出样品提取液蛋白浓度。 PCR-TRAP 银染定性检测取 20μl PCR 产物混合物加入 4μlⅢ型凝胶上样缓冲液,同时设置端粒酶活性阳性及阴性对照,上样于 % 聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。将凝胶置于银染固定液中轻轻振荡 30 min ,水洗 2~3 次后将凝胶移入 % 硝酸银染色液中,再将凝胶转入显色液( 3% 氢氧化钠、 % 甲醛)中,