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液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择、使用、保护和常有故障及清除
液相色谱的柱子往常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱,或是在硅胶表面键合
-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱;反相柱填料主要以硅胶为基质,在其表面键合非极性的十八烷
基官能团(ODS)称为C18柱,其余常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。此外还有离子互换柱,
GPC柱,聚合物填料柱等。本文要点介绍反相色谱柱的选择和使用:
一、反相色谱柱的选择

反相柱长处是固定相稳固,应用宽泛,可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料,使用时必定要注
意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8,流动相的PH值小于2时,会致使键合相
的水解;当PH值大于7时硅胶易溶解;常常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述状况,色谱柱
人口处会塌陷。相同填料各样不一样牌号的色谱柱不尽相同。假如流动相PH较高或常常使用缓冲液时,
建议选择PH范围大的柱子,比如戴安企业的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-。
(或称封口)
把填料的剩余硅羟基采纳封口技术进行端基封尾,可改良对极性化合物的吸附或拖尾;含碳量增
高了,有益于不易保存化合物的分别;填料稳固性好了,组分的保存时间重现性就好。假如待剖析的
样品属酸性或碱性的化合物,最好采纳填料经端基封尾的色谱柱。
—极性封尾C16固定相柱
戴安企业有28种种类的柱子,Acclaim反相柱填料高纯,金属含量极低,完整封尾。PH2-9范围内
兼容,低流失,高柱效。特别是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱,是最初商品化的磺酰氨-O
链接键的色谱柱,具极低的硅羟基活性,能在极性溶剂甚至100%水的条件下长久使用。对酸性和碱
液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择
性化合物有极为尖利的好的色谱峰形,与现有的一流色谱柱对比有更好的立体选择性。(下列图是
Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分别酸性化合物谱图的比较)
二、液相色谱柱的使用
色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为此后评论柱性能变化的参照。
在做柱性能测试时要依照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最正确条件),只有这
样,测得的结果才有可比性。但要注意:柱性能可能因为所使用的样品、流动相、柱温等条件的差别
而有所不一样。
1、样品的前办理
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用预办理柱除掉样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量互换而达到分别的目的,所以要求流动相具备以
下的特色:
a、流动相对样品拥有必定的溶解能力,保证样品组分不会积淀在柱中(或长时间保存在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反响
c、流动相的黏度要尽量小,以便获取好的分别成效;降低柱压降,延伸泵的使用寿命(可运用提
高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,最好使用对紫外汲取较低的
溶剂配制。
液相色谱柱的选择
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e、流动相沸点不要太低,不然简单产生气泡,致使实验没法进行。
液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择
、在流动相当制好后,必定要进行脱气。除掉溶解在流动相中的微量气体既有益于检测,还能够防备流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不一样的流速可获取不一样的柱效。关于一根特定的色谱
柱,要追求最正确柱效,最好使用最正确流速。,流速一般选择1ml/min,对
,。
入采纳最正确流速时,剖析时间可能延伸。可采纳改变流动相的清洗强度的方法以缩短剖析时间(如
使用反相柱时,可适合增添甲醇或乙***的含量)。
注意:
,特别是夏季使用缓冲溶液作为流动相不要留宿。最好加
入叠氮化钠,防备细菌生长。
,除掉微粒杂质。
,使用适合的流动相可延伸色谱柱的使用寿命,提升柱性能。

色谱柱的均衡
反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙***/水中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙***冲
洗色谱柱。请必定保证您剖析样品所使用的流动相和乙***/水互溶。每日用足够的时间以流动相来平
衡色谱柱,您就会在办理问题方面获取最大的"赔偿",并且您的色谱柱的寿命也会变得更长!操作步
骤:
均衡开始时将流速迟缓地提升,用流动相均衡色谱柱直到获取稳固的基线(缓冲盐或离子对试
液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择
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剂流速假如较低,则需要较长的时间来均衡)
液相色谱柱的选择
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液相色谱柱的选择
,应注意用纯水"过渡"即每日剖析开始前一定先用纯水冲刷30
分钟以上再用缓冲盐流动相均衡;剖析结束后一定先用纯水冲刷30分钟以上除掉缓冲盐以后再用甲
醇冲刷30分钟保护柱子。

长久使用的色谱柱,常常柱效会降落(柱子的理论塔板数减低)。能够对色谱柱进行重生,在有
条件的实验室应使用一个低价的泵进行柱子的重生。
建议用来冲刷柱子的溶剂体积
色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积
125-
250-
250-10mm20ml400ml
选择重生方法:
极性固定相(如Si,NH2*,DIOL基色谱填料)的重生:
正庚烷→***仿→乙酸乙酯→***→乙醇→水
非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8,CN等)的重生:水→乙***→***仿(或异丙醇)
→乙***→水
注意:
,因为NH2可能以铵根离子的形式存在,所以应当在水洗
,而后再用水冲刷至碱溶液完整流出。
,假如简单的用有机溶剂/水的办理不可以够完整洗去
硅胶表面吸附的杂质,。
色谱柱的保护
液相色谱柱的选择
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(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有必定的溶解度)
液相色谱柱的选择
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液相色谱柱的选择
-,尽量不超出该色谱柱的pH范围


,应在实验完成柱子冲刷洁净,并保存于甲醇或乙
***中
f.***化物的溶剂对其有必定的腐化性,故使用时要注意,柱及连结收内不可以长时间存留此类溶剂,
以防止腐化。
如何选择色谱柱
现代高效液相色谱中,分别成效利害的一个重要指标是色谱填的选择。可是色谱填料的选择范围很宽,
所以,要做适合的选择,一定对此有必定的认识和认识。

1·正相色谱
正相色谱用的固定相往常为硅胶(Silica)以及其余拥有极性官能团***基团,如(NH2,APS)和***基团(CN,
CPS)的键合相填料。
因为硅胶表面的硅轻基(SiOH)或其余极性基团极性较强,所以,分别的序次是依照样品中各组份的极
性大小,即极性较弱的组份最初被冲刷优秀谱柱。
正相色谱使用的流动相极性相对照固定相低,如:正己烷(Hexane)、***仿(Choroform)、二***甲烷
(MethyleneCloride)等。
2,反相色谱
反相色谱用的填料常是以硅胶为基质,表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。
反相色谱所使用的流动相极性较强,往常为水、缓冲掖与甲醇、乙情等的混淆物。
样品流优秀谱柱的次序是极性较强的组份最初被冲刷出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保
留。
液相色谱柱的选择
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液相色谱柱的选择
常用的反相填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H,(Phenyl)等。
液相色谱柱的选择
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液相色谱柱的选择
二·聚合物填料
聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚***丙烯酸醋等,其主要长处是在pH值为1一14均可使
用。
相关于硅胶基质的C18填料,这种填料拥有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分别
特别有效。
现有的聚合物填料的弊端是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低。
三、其余无机填料其余HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化因为其特别的性质,一般仅限于特别的用途。如,石墨化碳黑正渐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分别不一样于硅胶基质烷基键合相,
石墨化碳的表面即是保存的基础,不再需其余的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚
合物填料的保存能力更强。石墨化碳可用于分别某些几何异构体,因为在HPLC流动相中不会被溶
解,这种柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也能够用于HPLC。氧化铝微粒刚性强,可制成稳固
的色谱柱柱床,其长处是能够在PH高达12的流动相中使用。但因为氧化铝与碱性化合物的作用也
很强,应用范围遇到必定限制,所以未能宽泛应用。新式色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品
化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应用PH1-14,温度可达100℃。因为氧化锆填料是最
近几年才开始研究,加之面对的实验难度,其重要用途与优势尚在进行之中。
如何选择填料粒度当前,商品化的色谱填料粒度从1um到超出30um均有销售,而当前剖析分别主要用3和5um填料进行。填料的粒度主要影响填补柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,柱
压越大,柱压的增添限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选择性条件下,提升柱效可提升分别度,但不是独一的要素。假如固定相选择是正确,可是分别度不够,那么采纳更小的粒度的填料是很
实用的。3um填料填补柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提升近30%;但是,3um的色谱柱
的背压倒是5um的2倍。与此同时,柱效提升意味着在相同条件下能够采纳更短的色谱柱,即相同的塔板数或分别能力,可是柱长更短,以缩短剖析时间。此外,能够采纳低粘度的溶剂做流动相或增
加色谱柱的使用温度,比方用乙***取代甲醇,以降低色谱柱的压力。
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