原核表达系统的选择和高效表达策略.pptx

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李刚副教教授
教学内容
一、PCR引物的设计与与实验操作技技巧;二、、基因组文库库的建立与筛筛选;三、、定向进化技技术在微生物物酶制剂研究究中
的应用;四四、原核表达达系统的选择择和高效表达达策略;
五、真核表达达系统的选择择和高效表达达策略。
四、原核表达达系统的选择择和高效表达达策略
原核生物表达达系统主要包包括:
大肠杆菌表达达系统、枯草芽孢杆菌菌表达系统、链霉菌表达系系统等,其中应用最广广泛的是大肠肠杆菌表达系系统。
原核表达系统统的优点
1、细菌培养操操作简单、生生长繁殖快、、价格低低廉;
2、外源基因表表达产物的水水平高(如大肠杆菌中中目的蛋白的的表达量可超超过细菌总蛋蛋白量的80%);
3、基因背景和和表达特性清清楚。
大肠杆菌表达达系统
自20世纪70年代以来,大肠杆菌一直直是基因工程程中应用最为为广泛的表达达系统。尤其其是进入后基基因组时代以以来,有关蛋白结构构以及功能研研究的开展,对基因表达的的要求更高,
这时大肠杆菌菌往往是表达达的第一选择择。
大肠杆菌表达达系统的优缺缺点
优点:
大肠杆菌具有有培养条件简简单、生长繁繁殖快、安全全性好、
可以高效表达达不同外源基基因产物等特特点,是许多外源基基因
表达系统中最最好的一种,是目前研究最最深入、发展展也最完善的的表达系统,大量的有价值值的多肽和蛋蛋白质已在大大肠杆菌中获获得了超量表表达。
缺点:
大肠杆菌表达达体系与其他他表达体系相相比,也具有一些缺缺
点:①高效表达易形形成包涵体。。②不能进行行翻译后的加加工修饰,如糖基化、磷磷酸化及酰基基化等。
大肠杆菌表达达系统的操作作流程
大肠杆菌表达达系统操作的的一般程序如如下:获获得目目的基因-准准备表达载体体-将目的基基因插入表达达载体中(测测序验证)--转化表达宿宿主菌-诱导导靶蛋白的表表达-表达蛋蛋白的分析--扩增、纯化化、进一步检检测。
大肠杆菌表达达系统的基本本概念
首先讲述一些些大肠杆菌表表达的基本概概念:一个完整的表表达系统通常常包括配套的的表达载体和和表达菌株,如果是特殊殊的诱导表达达还包括诱导导剂,如果是是融合表达还还包括纯化系系统或者Tag检测等等。选择表达系统统通常要根据据实验目的来来考虑,比如表达量量高低,目标标蛋白的活性性,表达产物物的纯化方法法等等。主要归结在表表达载体的选选择上。
表达载体:我们关心的的质粒上的元元件包括启动子,多克隆位点,终止密码,融合Tag(如果有的话话),复制子子,筛选标记/报告基因等。通常,载载体很贵,我我们可以通过过实验室之间间交换得到免免费的载体。。但是要小心,,辗转多个实实验室和多个个实验室成员员之手的载体体是否保持原原来的遗传背背景?MCS是否还是原来来那个MCS?是我们要特特别注意的。。
大肠杆菌表达达系统的基本本概念
复制子:通常表达载体体都会选用高高拷贝的复制制子。pSC101类质粒是严谨谨方式复制,,拷贝数低,,pCoE1,pMBI(pUC)类的复制子的的拷贝数高达达500以上,是表达达载体常用的的。通常情况下质质粒拷贝数和和表达量是非非线性的正相相关,当然也不是是越多越好,,超过细胞的的承受范围反反而会损害细细胞的生长。。如果碰巧需要要2个质粒共转化化,就要考虑虑复制元是否否相容的问题题。筛选标记和报报告基因:氨苄青霉素抗抗性是最常见见的筛选标记记,卡那霉素或或者是新霉素素次之,四环环素,红霉素素和***霉素等等已经日渐式式微。抗性基基因的选择要要注意是否会会对研究对象象产生干扰,,比如代谢研研究中要留意意抗性基因编编码的酶是否否和代谢物相相互作用。在表达筛选中中要注意的问问题应该就是是LB倒板前加抗生生素的温度,,温度过高容容易导致抗生生素失效。今天耐青霉素素的超级细菌菌泛滥,不知知道是否有我我们实验人员员的功劳呢??大家“随便倒倒掉”已经获获得氨苄抗性性的大肠杆菌菌之前有没有有经过煮沸或或者消毒等处处理呢?从以前的一针针50万单位到现在在100多万个单位,,青霉素剂量量似乎越来越越大了。
大肠杆菌表达达系统的基本本概念
对于做表达来来说,如果不不是要研究启启动子的强弱弱,通常比较较少关心或者者用到报告基基因吧。绿色荧光蛋白白是最常用的的报告基因了了(注意选择适适用原核表达达版本的GFP),其他还有有半乳糖苷酶,荧光素酶等等。一些融融合表达Tag也有报告基因因的功能。启启动子、终终止子和核糖糖体结合位点点: 启动动子:启动子的强弱弱是对表达量量有决定性影影响的因素之之一。从转录模式上上看有组成型型表达和诱导导调控型表达达。lac和Tac,PL和PR,T7是最常用的启启动子。
转录终止子对对外源基因在在大肠杆菌中中的高效表达达有重要作用用——控制转录的RNA长度提高稳定定性,避免质质粒上异常表表达导致质粒粒稳定性下降降。放在启动动子上游的转转录终止子还还可以防止其其他启动子的的通读,降低低本底。转录录终止子有两两类,分别是是Rho因子作用下使使mRNA转录终止的终终止子和根据据模版上的对对称序列形成成发夹结构而而终止mRNA转录的终止子子。常见的是rrnB、rRNA操纵子的T1T2串连转录终止止子。