原核表达系统的选择和高效表达策略.pptx

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李刚副教授
教学内容
一、PCR引物的设计计与实验操操作技巧;;二、基基因组文库库的建立与与筛选;三三、定向向进化技术术在微生物物酶制剂研研究中
的应用;四四、原核核表达系统统的选择和和高效表达达策略;
五、真核表表达系统的的选择和高高效表达策策略。
四、原核表表达系统的的选择和高高效表达策策略
原核生物表表达系统主主要包括::
大肠杆菌表表达系统、枯草芽孢杆杆菌表达系系统、链霉菌表达达系统等,其中应用最最广泛的是是大肠杆菌菌表达系统统。
原核表达系系统的优点点
1、细菌培养养操作简单单、生长繁繁殖快、价价格低低廉;
2、外源基因因表达产物物的水平高高(如大肠杆菌菌中目的蛋蛋白的表达达量可超过过细菌总蛋蛋白量的80%);
3、基因背景景和表达特特性清楚。。
大肠杆菌表表达系统
自20世纪70年代以来,大肠杆菌一一直是基因因工程中应应用最为广广泛的表达达系统。尤尤其是进入入后基因组组时代以来来,有关蛋白结结构以及功功能研究的的开展,对基因表达达的要求更更高,
这时大肠杆杆菌往往是是表达的第第一选择。
大肠杆菌表表达系统的的优缺点
优点:
大肠杆菌具具有培养条条件简单、、生长繁殖殖快、安全全性好、
可以高效表表达不同外外源基因产产物等特点点,是许多外源源基因
表达系统中中最好的一一种,是目前研究究最深入、、发展也最最完善的表表达系统,大量的有价价值的多肽肽和蛋白质质已在大肠肠杆菌中获获得了超量量表达。
缺点:
大肠杆菌表表达体系与与其他表达达体系相比比,也具有一些些缺
点:①高效表达易易形成包涵涵体。②不不能进行翻翻译后的加加工修饰,如糖基化、、磷酸化及及酰基化等等。
大肠杆菌表表达系统的的操作流程程
大肠杆菌表表达系统操操作的一般般程序如下下:获获得目的基基因-准备备表达载体体-将目的的基因插入入表达载体体中(测序序验证)--转化表达达宿主菌--诱导靶蛋蛋白的表达达-表达蛋蛋白的分析析-扩增、、纯化、进进一步检测测。
大肠杆菌表表达系统的的基本概念念
首先讲述一一些大肠杆杆菌表达的的基本概念念:一个完整的的表达系统统通常包括括配套的表表达载体和和表达菌株株,如果是特殊的诱诱导表达还包括诱诱导剂,如果是融融合表达还包括纯纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常常要根据实验目的的来考虑,比如表达量高低低,目标蛋白的活活性,表达产物的的纯化方法等等。。主要归结在表达载载体的选择上。
表达载体:我们关心的质粒粒上的元件包括启动子,多克隆位点,终止密码,融合Tag(如果有的话),,复制子,筛选标记/报告基因等。通常,载体很很贵,我们可以通通过实验室之间交交换得到免费的载载体。但是要小心,辗转转多个实验室和多多个实验室成员之之手的载体是否保保持原来的遗传背背景?MCS是否还是原来那个个MCS?是我们要特别注注意的。
大肠杆菌表达系统统的基本概念
复制子:通常表达载体都会会选用高拷贝的复复制子。pSC101类质粒是严谨方式式复制,拷贝数低低,pCoE1,pMBI(pUC)类的复制子的拷贝贝数高达500以上,是表达载体体常用的。通常情况下质粒拷拷贝数和表达量是是非线性的正相关关,当然也不是越多多越好,超过细胞胞的承受范围反而而会损害细胞的生生长。如果碰巧需要2个质粒共转化,就就要考虑复制元是是否相容的问题。。筛选标记和报告基基因:氨苄青霉素抗性是是最常见的筛选标标记,卡那霉素或者是是新霉素次之,四四环素,红霉素和和***霉素等已经日日渐式微。抗性基基因的选择要注意意是否会对研究对对象产生干扰,比比如代谢研究中要要留意抗性基因编编码的酶是否和代代谢物相互作用。。在表达筛选中要注注意的问题应该就就是LB倒板前加抗生素的的温度,温度过高高容易导致抗生素素失效。今天耐青霉素的超超级细菌泛滥,不不知道是否有我们们实验人员的功劳劳呢?大家“随便倒掉””已经获得氨苄抗抗性的大肠杆菌之之前有没有经过煮煮沸或者消毒等处处理呢?从以前的一针50万单位到现在100多万个单位,青霉霉素剂量似乎越来来越大了。
大肠杆菌表达系统统的基本概念
对于做表达来说,,如果不是要研究究启动子的强弱,,通常比较少关心心或者用到报告基基因吧。绿色荧光蛋白是最最常用的报告基因因了(注意选择适用原原核表达版本的GFP),其他还有半乳糖苷酶,荧光素酶等等。一些融合表表达Tag也有报告基因的功功能。启动子、、终止子和核糖体体结合位点:启启动子:启动子的强弱是对对表达量有决定性性影响的因素之一一。从转录模式上看有有组成型表达和诱诱导调控型表达。。lac和Tac,PL和PR,T7是最常用的启动子子。
转录终止子对外源源基因在大肠杆菌菌中的高效表达有有重要作用——控制转录的RNA长度提高稳定性,,避免质粒上异常常表达导致质粒稳稳定性下降。放在在启动子上游的转转录终止子还可以以防止其他启动子子的通读,降低本本底。转录终止子子有两类,分别是是Rho因子作用下使mRNA转录终止的终止子子和根据模版上的的对称序列形成发发夹结构而终止mRNA转录的终止子。常见的是rrnB、rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。。