黄芩苷对肺癌H460细胞生物学特性及Wnt catenin信号通路的影响.pdf

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,,,,,,

,;
与细胞凋亡、血管生成及预后的关系〔J〕.浙江医学201234损伤大鼠心肌组织水通道蛋白1表达及蛋白激酶C活性的影响
():,;():
6405-7.〔J〕.中国针灸2017372157-61.
,,,
〔2021-06-12修回〕
againstlipopolysaccharideinducedapoptosisandinflammationofre-(编辑李男)
,;():
nalepithelialHK2cells〔J〕.ExpTherMed20181554243-52.
黄芩苷对肺癌细胞生物学特性及信号通路的影响
H460Wnt/β-catenin
侯从岭1雷小婷1芦晓帆1周超锋2李彬1
(河南省中医院1肺病科,河南郑州450002;2肿瘤科)
()
〔摘要〕目的探讨中药单体黄芩苷对人肺癌H460细胞增殖、凋亡、上皮间质转化EMT、侵袭和迁移生物学特性及
信号通路的影响方法采用细胞计数试剂盒()法检测不同浓度的黄芩苷对细胞细胞增殖的影
Wnt/β-catenin。CCK-8H460
,(),()
响并计算半数抑制浓度IC50。通过流式细胞术检测黄芩苷对H460细胞凋亡的影响实时荧光定量PCRqRT-PCR检测
()()(),
细胞中上皮性钙黏附素E-cadherin、神经性钙黏附素N-cadherin和波形蛋白Vimentin基因表达量划痕实验检测黄芩苷
,,
对H460细胞迁移能力的影响Transwell实验检测黄芩苷对H460细胞侵袭能力的影响Western印迹检测H460细胞中增殖细
胞核抗原()相关蛋白()基质金属蛋白酶()及信号通路连环蛋白
PCNA、Bcl-2XBax、MMP-2、MMP-9Wnt/β-cateninWnt1、β-
()等关键蛋白表达情况结果黄芩苷可抑制细胞增殖,且呈浓度依赖性关系,对细胞的为
β-catenin。H460H460IC50
();黄芩苷以浓度依赖性促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭和迁移;结果发现黄芩苷能
±-PCR
,;
够促进H460细胞中E-cadherin基因表达抑制N-cadherin和Vimentin基因表达黄芩苷可下调PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白
表达,上调蛋白表达,且能够抑制信号通路中和蛋白表达结论黄芩苷可抑制人肺癌
BaxWnt/β-cateninWnt1β-catenin。
细胞增殖侵袭和迁移,促进细胞凋亡,该过程的分子机制可能与抑制信号通路的激活有关
H460、EMT、Wnt/β-catenin。
关键词黄芩苷;信号通路;肺癌细胞;生物学特性
〔〕Wnt/β-cateninH460
();:
〔中图分类号〕〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202202202-0426-.1005-
肺癌是具有高发病率和死亡率的恶性肿瘤之关于黄芩苷对人肺癌H460细胞生物学特性的影响
,
一也是全球癌症相关死亡的主要原因。非小细胞及分子机制的研究鲜有报道。本研究体外培养
肺癌()占所有肺癌中,包括鳞状,
NSCLC75%~85%H460细胞观察不同浓度的黄芩苷对H460细胞增
细胞癌腺癌和大细胞肺癌〔1〕目前尽管外科手术()
、。殖、凋亡、上皮间质转化EMT、侵袭和迁移的影
联合放化疗取得了进展,但患者的预后仍响,并探究其对信号通路活性的影
、NSCLCWnt/β-catenin
然很差,所有阶段和亚型的肺癌患者年生存率仍,
5响以期为黄芩苷在肺癌临床应用中提供实验依据。
然低至11%〔2〕。转移和复发是导致肺癌患者死亡
的主要原因,且放疗和化疗对患者的毒副作用较大,
1材料与方法
严重影响患者生活质量并制约治疗效果〔3〕因此(
。>%上海源叶生物
迫切需要寻找新的安全有效毒副作用低的抗癌);(
、、科技有限公司人肺癌细胞株H460中国科学院
剂黄芩苷是从中药黄芩中提取出来的一种黄***类);
。上海生科院生物化学与细胞学研究所胰蛋白酶、
化合物,具有广泛的药理作用,如抑菌抗炎和抗癌();
、RPMI1640培养基、小牛血清美国Gibco公司
,
等多种生理效能〔45〕黄芩苷的抗癌作用已在不同();
。CCK-8试剂上海碧云天生物技术研究所膜联蛋
类型的癌细胞中得到证实,包括乳腺癌细胞肝细胞白()碘化丙啶()细胞凋亡检测
、AnnexinⅤ-FITC/PI
癌细胞及卵巢癌细胞〔6~8〕体内研究表明,黄芩苷();(
。试剂盒日本TaKaRa公司RNA提取试剂盒北
,
对结肠癌、鼻咽癌等具有显著的治疗作用〔910〕。但京康为世纪生物科技有限公司);反转录试剂盒(大
);
连宝生物工程有限公司SYBRGreenqPCRMaster
:(),,,
通信作者芦晓帆1987-女博士主要从事肺病肿瘤基础与临床试剂盒(美国公司);孔径
研究MixGene-FociBiotech
。();
:(),,,的小室基质胶美国公司增
第一作者侯从岭1981-男主治医师主要从事肺病肿瘤的基础8μmTranswell、BD
殖细胞核抗原()抗体抗体连环蛋
与临床研究。PCNA、Wnt1、β-
侯从岭等黄芩苷对肺癌细胞生物学特性及信号通路的影响第期
H460Wnt/β-catenin2·427·
白catenin抗体美国Abcam公司辣根过氧化物AGACTG-3'波形蛋白Vimentin上游引物5'-
,
酶标记的山羊抗鼠IgG北京中杉金桥生物技术有GAGTCCACTGAGTACCGGAG-3'下游引物5'-AC-
限公司相关蛋白抗体基质金属蛋上游引物
Bcl-2XBax、GAGCCATTTCCTCCTTCA-3'β-actin5'-
,
白酶MMP-2抗体、MMP-9抗体武汉博士德生物AAACTGGAACGGTGAAGGTG-3'下游引物5'-
工程有限公司。AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3'。实验数据采用相
细胞培养人肺癌细胞常规复苏后接对定量-△△Ct法计算,以为内参
-actin。
种在含10%
养瓶中,将培养瓶放置在饱和湿度细的影响对数期的细胞以6个孔均匀
、5%CO2、37℃H4601×10/
,,,
胞恒温培养箱中培养在倒置显微镜下观察细胞生的种植到6孔板中放置在恒温培养箱培养待细胞
,,,,
长状态及时更换新鲜的培养液细胞长满瓶底贴壁汇合度到90%以上时弃去培养上清液使用
,,,
90%时以胰蛋白酶消化H460细胞以1∶3进行传灭菌的移液枪枪头在各孔中间垂直划横线以PBS
,
代。处于对数生长期的H460细胞用于实验。洗去划掉的细胞分别向各孔细胞中加入含不同浓
法检测黄芩苷对细胞增殖的影度黄芩苷的无血清培养液,
-8H4600、25、50μmol/L37℃
,,
响将对数生长期的H460细胞以胰酶消化按照培养箱继续培养48h使用倒置显微镜观察黄芩苷
4,,
1×10个/孔接种到96孔板中放置在常规培养箱中干预后H460细胞愈合情况计算划痕愈合率=初
,,
继续培养待细胞充分贴壁后除去旧培养液分别加始划痕宽度-48h划痕宽度/初始划痕宽度×
入含不同浓度
0、25、50、100、150、200、250μmol/L100%。
,

孔,其中为对照组在培养箱中继能力的影响取稀释的基质胶添加到
0μmol/L。37℃100μlTran-
,,,
续孵育48h参照CCK-8试剂盒说明书向每孔细胞swell小室的上室37℃放置过夜备用。收集对数
中加入溶液,继续孵育,使用期的细胞,加入无血清培养液重悬细胞,分别
100μlCCK-837℃4hH460
全自动酶标仪检测波长为处各孔细加入不同浓度黄芩苷,取
450nmH4600、25、50μmol/L200μl
,,
胞吸光度A值计算细胞增殖抑制率=1-实验组细胞悬液加入到Transwell小室的上室下室加入
值对照组值,并计算黄芩苷对细胞的含小牛血清的培养液,培养箱培养
A/A×100%700μl10%37℃
,
半数抑制浓度IC50。48h。用棉签小心擦去上室未穿膜的细胞以4%多
,,
%结晶紫染色10minPBS洗
,,
影响对数生长期的H460细胞以胰酶消化使用去染液风干后在倒置显微镜×100下随机取5个
,,
培养液重悬细胞并接种到6孔板中放置在细胞培视野观察并计数侵袭细胞数。
,

黄芩苷的培养液,处理,收蛋白表达的影响以不同浓度
0、25、50μmol/L48h0、25、50μmol/L
集细胞,按照试剂盒说明书处黄芩苷干预细胞,分别收集各浓度组细
AnnexinⅤ-FITC/PIH46048h
,,,
理细胞使用流式细胞仪检测各浓度组H460细胞胞加入RIPA细胞裂解液在冰上裂解提取细胞中
凋亡情况。总蛋白。使用二喹啉甲酸BCA法测定蛋白浓度。
检测黄芩苷对细胞标志按照每孔蛋白样品上样,行十二烷基硫酸钠
-PCRH460EMT40μg
,
基因表达的影响对数生长期的H460细胞以1×SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳PAGE蛋白分离后
6,,,
10个/孔接种到6孔板中加入不同浓度0、25、转膜、封闭分别加入相应稀释的一抗4℃孵育过
的黄芩苷干预,收集细胞,使用夜,再加入稀释的二抗,室温孵育,以电化学发光
50μmol/L48h2h
,,,
RNA提取试剂盒提取各组细胞中总RNA按照反转ECL显影使用凝胶成像系统拍照将目的蛋白条
录试剂盒说明书合成,使用带灰度值与条带灰度值的比值为目的蛋白
cDNASYBRGreenqPCRβ-actin
MasterMix试剂盒进行PCR扩增检测目的基因相对相对表达水平。
表达量。上皮型钙黏附素E-
,
5'-CGTAGCAGTGACGAATGTGG-3'下游引物5'-方差分析、SNK-q检验。
CTGGGCAGTGTAGGATGTGA-3'神经性钙黏附素
N-cadherin上游引物5'-TCAGGCGTCTGTAGAG-2结果
,
GCTT-3'下游引物5'-ATGCACATCCTTCGATA-、25、
·428·中国老年学杂志2022年1月第42卷
黄芩苷细胞增殖抑制率分
50、100、200、400μmol/L
表不同浓度黄芩苷对细胞中
±%、±%、±1H460E-cadherin、
和基因表达的影响,
%、±%、±%、N-cadherinVimentinx±sn=3
,组别
±%。随着黄芩苷浓度的增加对E-cadherinN-cadherinVimentin
组
细胞增殖抑制率逐渐升高,且具有一定的浓度0μmol/±±±
H460组
依赖关系,计算得出黄芩25μmol/±±±
F==。组
50μmol/±±±
苷对细胞为,因
±.
值
此选择1/
为后续实验加药标准浓度与组比与组比下表同
50μmol/L。0μmol/L1P<<
黄芩苷对细胞凋亡的影响与

组相比,
〔±%〕25μmol/L〔±组相比,组和组
和组组0μmol/L25μmol/L50μmol/L
%〕50μmol/L〔±%〕细胞划痕愈合率和侵袭细胞数均显著降低
细胞的凋亡率明显升高与H460
H460P<,组
组相比,组细胞的凋亡P<
25μmol/L50μmol/LH460细胞划痕愈合率和侵袭细胞数均显著降低
率升高见图H460
P<。1。
P<。见表2。
表2不同浓度黄芩苷对H460细胞迁移和
,
侵袭的影响x±sn=3
组别划痕愈合率%侵袭细胞数个
组
0μmol/±±
组
25μmol/±±
组
50μmol/±±

图流式细胞术检测各组细胞凋亡

黄芩苷对细胞的影响与黄芩苷对细胞中和
、Bax、MMP-2
组相比,组和组细胞中蛋白表达的影响与组相比,
25μmol/L50μmol/LH460MMP-90μmol/L
基因表达水平显著升高,组和组细胞中
E-cadherinP<-25μmol/L50μmol/LH460PCNA、
,
cadherin和Vimentin基因表达水平显著降低MMP-2和MMP-9蛋白水平明显降低P<
与组相比,组蛋白水平明显升高与组
P<<
细胞中基因表达水平组升高相比,组细胞中和
H460E-cadherinP<50μmol/LH460PCNA、MMP-2
,,
-cadherin和Vimentin基因表达水平显著降MMP-9蛋白水平明显降低P<
低P<。见表1。明显升高P<。见表3、图2。
表不同浓度黄芩苷对细胞中及蛋白表达的影响,
3H460PCNA、Bax、MMP-2、MMP-9、Wnt1β-cateninx±sn=3
组别
PCNABaxMMP-2MMP-9Wnt1β-catenin
组
0μmol/±±±±±±
组
25μmol/±±±±±±
组
50μmol/±±±±±±


黄芩苷对信号通路活性的影响均明显下调与组相比,
-cateninP<
与组相比,组和组细胞中和蛋白
0μmol/L25μmol/L50μmol/L50μmol/LH460Wnt1β-catenin
组细胞中和蛋白表达水平表达水平均明显下调见表图
H460Wnt1β-cateninP<。3、3。
侯从岭等黄芩苷对肺癌细胞生物学特性及信号通路的影响第期
H460Wnt/β-catenin2·429·
,
增殖通过上调Bax蛋白表达诱导细胞凋亡。
EMT的特征在于上皮特征的丧失和间充质特
,
征的获得间充质标记物包括N-cadherin和Vim-
,
〔1920〕
entin的诱导分别是EMT的标志性事件。本
,
研究结果表明黄芩苷抑制EMT正如N-cadherin和
,
Vimentin基因表达水平降低上皮标志物E-cadherin
,
基因表达水平升高所示。众所周知EMT与癌症转
〔21〕,
移密切相关。因此黄芩苷抑制肺癌H460细胞
EMT过程可能是黄芩苷抑制H460细胞侵袭和转移
的潜在机制。此外本研究划痕愈合和Transwell实
,
验结果发现黄芩苷可抑制H460细胞迁移和侵袭
能力能够降解细胞外基质和基底膜
图印迹检测细胞中。MMPECM
2WesternH460PCNA、Bax、的各种组分和均属于家族,
和蛋白水平。MMP-2MMP-9MMP
MMP-2MMP-9,
一旦MMP-2和MMP-9被激活它们就能够降解
,
ECM中的胶原蛋白从而增加癌细胞的侵袭和转
,
〔2223〕,
移。本实验Westernblot结果显示黄芩苷诱
导的H460细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平
,
显著降低。因此黄芩苷诱导的MMP-2和MMP-9
蛋白表达的抑制可被认为是黄芩苷抑制肺癌细胞侵
,
袭和转移的重要机制。有报道称黄芩苷通过调控
信号通路促进毛囊发育及胚胎粘连
Wnt/β-catenin
,
和植入〔2425〕提示黄芩苷可能通过调控
。Wnt/β-
信号通路发挥抑癌作用信
图印迹检测各组细胞中和catenin。Wnt/β-catenin
3WesternH460Wnt1号通路属于经典的信号通路,在多种细胞增
蛋白水平Wnt
β-catenin
殖、分化、发育、侵袭和迁移过程中发挥关键作
用〔26〕信号通路在肿瘤发生和癌细
讨论。Wnt/β-catenin
3胞侵袭和迁移中的作用已广泛应用于包括肺癌在内
目前的治疗措施在治疗人类肺癌方面尽管取得
,
的多种人类癌症中〔2728〕针对信号
了进展,但肺癌仍然是人类癌症死亡的主要原因。Wnt/β-catenin
。通路可能是一种有效的抗癌策略最近报道,一些
因此,治疗肺癌患者需要更有效的药物及疗法传。
。化合物通过在癌细胞中抑制信号通
,Wnt/β-catenin
统中医在中国和东亚地区很受欢迎并在现代医疗,
路而发挥其抑癌作用〔2930〕本研究发现,黄芩苷能
系统中发挥积极作用,包括治疗癌症患者,因此可被。
够以剂量依赖性下调信号通路中关
Wnt/β-catenin
认为是治疗人类癌症的潜在有效策略〔11〕天然传
。,
键蛋白分子Wnt1和-catenin的表达量表明黄芩
统中药历来是抗癌药物的重要来源,其中一些目前β
苷处理细胞后信号通路被抑
,H460Wnt/β-catenin
已用于临床实践〔1213〕中药因其高效且毒性较小,
。制提示黄芩苷可能通过抑制信号
。Wnt/β-catenin
因此作为潜在的治疗剂被广泛研究黄芩苷是一种
。通路的活性发挥抑制肺癌的作用。
从中药黄芩中提取的有效活性物质,目前已被证实,
总之黄芩苷在肺癌H460细胞中的抑制细胞
其具有广泛抗癌作用〔14〕龙进〔15〕报道显示,黄芩
。增殖、EMT、侵袭和转移及诱导细胞凋亡的作用和机
苷对肺腺癌细胞具有明显的增殖抑制和凋亡
A549制。黄芩苷通过诱导调控PCNA、Bax、MMP-2和
诱导作用郭爱萍等〔16〕发现黄芩苷能够抑制
A549MMP-9蛋白表达水平表现出影响H460细胞生物学
细胞增殖和迁移在细胞增殖启动中发挥重特性的作用黄芩苷干预细胞可抑制
。PCNA。H460Wnt/β-
要作用,目前已将其作为肿瘤细胞处于增殖状态的,
catenin信号通路进而诱导细胞生长、侵袭、迁移抑
指标之一〔17〕属于家族成员,其具有细
。BaxBcl-2制和细胞凋亡。黄芩苷作为治疗肺癌的候选者具有
胞凋亡促进的作用,目前多用于肿瘤研究〔18〕本实巨大的潜力抑制信号通路可能是
。。Wnt/β-catenin
验提示黄芩苷能够能够下调PCNA的表达抑制细胞开发新型抗癌药物的重要策略。
·430·中国老年学杂志2022年1月第42卷
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