广西地方标准《甘蔗梢腐病的鉴定检测方法》（征求意见稿）.doc

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DB45
广西壮族自治区地方标准
DB 45/ T XXXX—XXXX
甘蔗梢腐病的鉴定检测方法
Methods for the identification and detection of Sugarcane Pokkah Boeng disease
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2015 - XX - XX发布
2015 - XX - XX实施
广西壮族自治区质量技术监督局发布
前言
本标准按照GB/T —2009给出的规则起草。
本标准由广西壮族自治区农业厅提出。
本标准起草单位:亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、广西大学。
本标准主要起草人:张木清、徐世强、王继华、魏晶晶、暴怡雪、覃丽芳。
甘蔗梢腐病的鉴定检测方法
范围
本标准规定了甘蔗梢腐病的鉴定技术及其致病菌的qPCR和常规PCR的检测方法。
本标准适用于甘蔗植株叶片、种苗及种茎中甘蔗梢腐病及其病原菌的快速诊断及检测。
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
甘蔗梢腐病 Sugarcane Pokkah Boeng disease
甘蔗梢腐病是一种真菌性病害,病原菌无性阶段为半知菌亚门镰孢属串珠镰孢菌Fusarium moniliforme Sheldon,有性阶段为子囊菌亚门赤霉属藤仓赤霉菌Gibberella fujikuroi (Sawada)Wollenw,主要危害甘蔗梢部,严重时导致甘蔗梢部坏死。高温高湿天气有利于病害流行,病原菌分生孢子主要随气流传播。
Ct值 Cycle Threshold
每个反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
ITS Internal Transcribed Spacer
在rDNA基因中, rDNA和 28S rDNA基因间隔序列称为(ITS),它的长度和序列变化较大,将其扩增物进行 RFLP 或序列分析,可用于对真菌的不同生物型、菌株、种、属进行分类鉴定。
缩略词
下列缩略词适用于本文件:
qPCR:Real-time Quantitative PCR Detecting System,实时荧光定量核酸扩增检测系统;
PCR:Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应;
DNA: Deoxyribonucleic acid, 脱氧核糖核酸;
Taq 酶:Taq DNA 聚合酶;
dNTPs:四种脱氧三磷酸核苷酸混合液;
FAM:6-羧基荧光素。
原理
通过对中国大陆甘蔗各产区的甘蔗梢腐病菌进行形态学和分子生物学鉴定,结合ITS序列聚类分析,初步鉴定中国大陆甘蔗梢腐病病原为镰刀菌(Fusarium)的两个种, gx1 (Fv) and gx2 (Fp),其中gx1 为优势种,主要发生在夏季,gx2主要发生在冬季。因此,根据gx1和gx2两个种的ITS序列易变异区设计特异引物和Taq Man探针,通过qPCR技术和常规PCR技术对甘蔗梢腐病的病原菌进行快速检测和准确鉴定。
仪器和用具
主要仪器
高速冷冻离心机,PCR仪,荧光定量PCR仪、电泳装置、凝胶成像系统、酶标仪、恒温培养箱