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论 著基础研究
PTEN对糖尿病肾病肾间质纤维化的作用及其机制
刘兴梅1,沈燕2,班晓霞1,何玉1,李红梅1,何晓兰3,张华1*
1贵州省人民医院检验科,贵阳 550002;2贵州省人民医院肾内科,贵阳 550002;3贵州省人民医院病理科,贵阳
550002
[摘要] 目的 探讨同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)对糖尿病肾病
[中图分类号] ;
肾间质纤维化的作用及其可能机制。方法 将体外培养的大鼠近端肾
[文献标志码] A
小管上皮(NRK52E)细胞分为正常糖(NG)组、高糖(HG)组及高渗(MA)
[DOI]组,采用Westernblotting检测各组PTEN、LC3、P62、Ⅰ型胶原和Ⅲ型
.0577-。另将NRK52E细胞分为正常糖对照(NG)组、高糖对照
(HG)组和高糖过表达PTEN(HG+pPTEN)组,采用激光共聚焦显微镜观察
[声明]
本文所有作者声明无利益冲突PTEN对自噬的影响,并在荧光显微镜下观察PTEN对胶原表达的影响。
结果 Westernblotting检测结果显示,与NG组比较,HG组PTEN、LC3表
[引用本文]达水平明显降低,而P62、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达水平明显升高,差异
刘兴梅,沈燕,班晓霞,
均有统计学意义(),而MA组PTEN、LC3、P62、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶
肾病肾间质纤维化的作用及其机制[J].解<
原表达水平无明显变化。激光共聚焦显微镜观察结果显示,HG组红色斑
放军医学杂志,2022,47(5):435-441.
点和黄色斑点数减少,表明存在明显的自噬抑制,而其余两组未见明显自
[收稿日期] 2021-07-23噬抑制。细胞免疫荧光染色结果显示,HG组PTEN红色荧光减弱、表达降
[录用日期] 2021-09-29低,胶原荧光染色增强、表达升高,而其余两组未见明显变化。结论 高
[上线日期] 2022-03-23
糖培养的肾小管上皮细胞中PTEN表达降低,自噬被抑制,进而可加重肾
纤维化;过表达PTEN后,可恢复自噬并缓解肾纤维化病变的进展。
[关键词] 糖尿病肾病;同源性磷酸酶-张力蛋白;自噬;肾间质纤
维化
EffectandmechanismofPTENonrenalinterstitialfibrosisindiabeticnephropathy
LiuXing-Mei1,ShenYan2,BanXiao-Xia1,HeYu1,LiHong-Mei1,HeXiao-Lan3,ZhangHua1*
1DepartmentofClinicalLaboratory,2DepartmentofNephrology,3DepartmentofPathology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,
Guiyang550002,China
*Correspondingauthor,E-mail:******@
ThisworkwassupportedbytheScienceandTechnologyFoundationofGuizhouProvince[(2020)1Y305]
[Abstract] Objective Toexploretheeffectandmechanismofphosphataseandtensinhomolog(PTEN)onrenal
WecultureNRK52Ecellsinvitro,cellswererandomlyassignedto
threegroups:normalglucosegroup(NG),highglucosegroup(HG)andmannitolgroup(MA),Westernblottingwasused
todetecttheproteinlevelsofPTEN,LC3,P62,collagen-ⅠandⅢ
collagen,theNRK52Ewererandomlyassignedtothreegroups:NGgroup,HGgroupandHG+pPTENgroup,theautophagy
changeswereobservedbylaserconfocalmicroscopy,andthechangesofcollagenwereobservedbyfluorescencemicroscopy.
Results Westernblottinginvivoshowedthat,comparedwithNGgroup,theexpressionlevelsofPTENandLC3were
decreased,butofP62,collagen-ⅠandⅢobviouslyincreasedinHGgroup(),whilenoobviouschangeoftheexpression
<
ofPTENandLC3,P62,collagen-ⅠandⅢ,thenumberofredspotsand
yellowspotsweredecreasedandsignificantautophagyinhibitioninHGgroup,therewerenosignificantautophagyinhibitionin
,theredfluorescenceofPTENandproteinexpression
[基金项目] 贵州省科技计划项目[黔科合基础(2020)1Y305]
[作者简介] 刘兴梅,医学博士,主要从事肾脏病机制方面的研究
[通信作者] 张华,E-mail:******@
436解放军医学杂志 2022年5月28日 第47卷 第5期
weredecreased,thecollagenfluorescencestainingandproteinexpressionwereincreasedinHGgroup,therewerenosignificant
InNRK52Ecellsunderhighglucose,PTENexpressionreducedsignificantly,
autophagywasinhibited,
progressionofrenalinterstitialfibrosis.
[Keywords] diabeticnephropathy;phosphataseandtensinhomolog;autophagy;interstitialfibrosis
据估计,全世界糖尿病的患病人数到2045年将NRK52E用含10%胎牛血清及DMEM培养基在
[1]
高达7亿。糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)37℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞融合度达
是致死性最严重的糖尿病并发症,也是导致肾功能80%~90%时进行细胞传代。吸掉原培养液,PBS清
不全的主要原因[2-3],随着病情进展可发生肾小管洗,%胰蛋白酶消化细胞,
间质纤维化。同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase1:4传代。
andtensinhomolog,PTEN) Westernblotting检测PTEN、LC3、P62、
使磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化转变为磷脂酰肌醇二Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平 将对数生长期
磷酸而失活,负性调控PI3K/Akt通路,同时可激活NRK52E细胞随机分为3组:正常糖(NC,
蛋白磷酸酶活性,负性调控黏着斑激酶/P130信号葡萄糖)组、高糖(HG,30mmol/L葡萄糖)组、高渗
来抑制细胞的存活、增殖,从而延缓肿瘤生长[4],(MA,+)组。
涉及血管[5]、心脏[6]、肺[7]和肾脏纤维化[8]等领域。培养48h后,吸弃各组细胞培养基,PBS洗3次,吸
已有研究发现,PTEN可通过不同信号通路影响肾干后加入细胞裂解液1ml(含RIPA裂解液980l/ml,
μ
脏纤维化的进程[9-13]。自噬为溶酶体降解途径,可PMSF10l/ml,磷酸酶抑制剂10l/ml),充分裂
μμ
参与细胞质成分降解,以维持细胞功能和代谢的平解,用细胞刮刀刮下细胞,将蛋白质上清转至另
衡[14-15]。微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)。BCA法进行蛋白样品定量,
别是自噬起始和完成的标志物,且LC3Ⅱ与LC3Ⅰ根据测得的蛋白浓度,加入2×SDS-PAGE蛋白上
的比值常用于监测自噬的激活[16]。激活转录因子4或样缓冲液使各样品浓度为3g/l,充分混匀,沸
μμ
嘌呤能受体可通过抑制自噬促进肾间质纤维化[17-18]。水煮开10min,进行蛋白样品变性。然后依次进
可见,PTEN、自噬均在DN的发病机制中扮演重要行制胶,电泳,转膜,封闭,洗膜,分别加入一
角色。然而,PTEN与自噬及肾间质纤维化三者间抗PTEN(1:1000)、LC3(1:1000)、P62(1:1000)、
的相互作用机制尚不完全清楚。本研究旨在观察Ⅰ型胶原蛋白(1:1000)、Ⅲ型胶原蛋白(1:800)和
PTEN在高糖环境下对大鼠近端肾小管上皮细胞的抗-actin(1:4000),4℃冰箱摇床孵育过夜,洗
β
作用,并探讨体外干预PTEN表达对自噬及肾间质膜,然后加入二抗(1:4000)孵育,洗膜,ECL液
纤维化的影响机制,以期为DN的临床治疗寻找新浸泡显色,Bio-Rad凝胶成像系统自动扫描胶片,
的有效靶点。检测PVDF膜上的目的蛋白,ImageJ软件分析条带
强度。
1 材料与方法
激光共聚焦显微镜观察自噬流 将对数
细胞及试剂 大鼠近端肾小管上皮细胞生长期NRK52E细胞随机分为3组:正常糖对照
(NRK52E)购自美国ATCC细胞库。ClarityTMWestern(NG)组、高糖对照(HG)组和高糖过表达PTEN
ECLsubstrate购自美国Bio-Rad公司,DMEM培养(HG+pPTEN)组,然后各组转染自噬双标腺病毒
基、胎牛血清购自美国Gibco公司,雷帕霉素购自mRFP-GFP-LC3质粒16h,吸弃细胞培养基,换成
美国MedChemExpress公司,鼠抗-actin单克隆抗含10%FBS的DMEN培养基,在HG+pPTEN组细胞
β
体购自中国普美生物科技公司,兔抗PTEN和兔抗中使用LipofectamineTM3000转染PTEN过表达质粒,
P62单克隆抗体购自英国Abcam公司,兔抗LC3A/B同时每组细胞加入100nmol/L的自噬诱导剂雷帕霉
单克隆抗体购自美国CST公司,兔抗Ⅰ型胶原和Ⅲ素,以提高整体自噬水平,便于观察各组间自噬的
型胶原蛋白单克隆抗体购自美国Sigma公司。自噬差异,共培养48h,以复温的PBS(37℃)清洗2次,
双标腺病毒mRFP-GFP-LC3质粒购自上海汉恒生物每孔加入200l4%多聚甲醛,室温固定30min后冷
μ
科技有限公司,过表达PTEN质粒(CKP04-PTEN)PBS洗3次,DAPI染核,室温10min,冷PBS洗2次,
购自中国普美生物科技公司。留少许PBS,加入盖玻片封片,激光共聚焦显微镜
方法观察自噬变化。采用自噬溶酶体(mRFP)标记及追
细胞培养 大鼠近端肾小管上皮细胞踪LC3,mRFP呈红色斑点,红绿荧光(RFP+GFP)合
MedJChinPLA,,,May28,2022437
并后呈黄色斑点即自噬体,通过不同颜色斑点计数PTEN表达水平无明显变化,因而排除了渗透压对
可清楚观察自噬流。PTEN表达的影响(图1)。
荧光显微镜观察Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的变化
PTEN
。HG组细胞采用LipofectamineTM
3000转染PTEN过表达质粒,6h后去掉细胞培养
-actin
基,换成含10%FBS的DMEN培养基,培养48h,β
以复温的PBS(37℃)洗2次,每孔加入200l4%
μ
聚甲醛,室温固定30min后,%
基醚洗3次,3%BSA封闭1h,冷PBS清洗3次,
-actin)
最佳稀释比例PTEN抗体(1:200)、Ⅰ(1)
(/
体(1:200)和Ⅲ型胶原蛋白抗体(1:200),4℃
夜,冷PBS清洗,加入二抗(Cy3标记羊抗兔,稀释PTEN蛋白相对表达量0
NG组HG组MA组
比例1:150)室温孵育3h,冷PBS清洗,DAPI染核,
图1 各组NRK52E细胞PTEN蛋白的表达水平(Western
室温10min,冷PBS清洗,留少许PBS,加入盖玻片blotting,n=3)
封片,荧光显微镜下观察胶原的染色变化。 ProteinexpressionlevelsofPTENinNRK52Ecellsof
统计学处理 (Westernblotting)(n=3)
析。数据符合正态分布,且通过方差齐性检验,-张力蛋白;与NG组比较,(1)
<
以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,进
一步两两比较采用SNK-q检验。 高糖培养NRK52E细胞中LC3、P62、Ⅰ型和
<
计学意义。Ⅲ型胶原蛋白的表达 Westernblotting检测结果显
示,与NG组比较,HG组LC3表达降低(),
2 结 果<
P62、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显升高
高糖培养NRK52E细胞中PTEN的表达 (),而MA组LC3、P62、Ⅰ型和Ⅲ
<<
Westernblotting检测结果显示,与NG组比较,型胶原蛋白的表达水平差异无统计学意义()
>
HG组PTEN表达水平明显降低(),而MA组(图2)。
<

HG组
LC3-Ⅰ(2)
MA组
LC3-Ⅱ

P62
(2)
Ⅰ型胶原
(1)

Ⅲ型胶原蛋白相对表达水平
(1)
-actin
β0
NG()+–+
-actin-actin-actin
HG(30mmol/L)–+–/LC3-Ⅰβββ
P62/
MA(30mmol/L)––+Ⅱ
LC3-Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原/
图2 各组NRK52E细胞中LC3、P62、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达水平(Westernblotting,n=3)
ProteinexpressionlevelsofLC3,P62,collagen-Ⅰandcollagen-ⅢinNRK52Ecells(Westernblotting,n=3)
-轻链3;与NG组比较,(1),(2)
<<
激光共聚焦显微镜观察自噬流变化 PTEN对胶原表达的影响 细胞荧光染色结
聚焦显微镜观察结果显示,与NG组比较,HG组果显示,与NG组比较,HG组PTEN红色荧光减
红色斑点和黄色斑点数减少,HG+pPTEN组红色弱,胶原荧光染色增强,HG+pPTEN组PTEN染色
斑点变化不大,黄色斑点数有所增加。与HG组比有所恢复,胶原染色无明显变化。与HG组比较,
较,HG+pPTEN组红色斑点和黄色斑点数明显增加HG+pPTEN组PTEN红色荧光增强,胶原荧光染色
(图3)。减弱(图4)。
438解放军医学杂志 2022年5月28日 第47卷 第5期
mRFPGFPDAPI合并
NG组
50m50m50m50m
μμμμ
HG组
50m50m50m50m
μμμμ
HG+pPTEN组
50m50m50m50m
μμμμ
图3 激光共聚焦显微镜检测过表达PTEN后NRK52E细胞中自噬流变化
ChangesofautophagicflowinNRK52Ecellsanalyzedbylaserconfocalmicroscopy,usingpPTENplasmidover-expressed
PTEN
-张力蛋白
NG组HG组HG-pPTEN组
PTEN
25m25m25m
μμμ
Ⅰ型胶原
25m25m25m
μμμ
Ⅲ型胶原
25m25m25m
μμμ
图4 NRK52E细胞PTEN及Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白免疫荧光染色
PTEN,collagen-Ⅰandcollagen-ⅢproteininNRK52Ecells(Immunofluorescencestaining)
-张力蛋白
MedJChinPLA,,,May28,2022439
因后,自噬受到明显抑制,可进一步加重细胞凋亡
3 讨 论[29]
与肾小管细胞纤维化。用STZ诱导DN的动物研
随着病程进展,DN将发展为慢性肾脏病,是究中发现,敲除IL-17A可影响自噬形成过程,使细
终末期肾病(end-stagerenaldisease,ESRD)的主要胞内稳态失衡,促进DN的发生发展[30]。本研究发
原因[19]。DN的特征之一为细胞外基质(extracellular现,高糖刺激近端肾小管上皮细胞后自噬被抑制,
matrix,ECM)蛋白如肾小球和基底膜的系膜和肾肾间质纤维化加重,提示在高糖环境下,PTEN介
小管间质中的胶原、层黏蛋白和纤维连接蛋白导的肾脏间质纤维化过程中自噬水平明显降低。
(fibronectin,FN)的沉积;ECM表达增加可使肾小研究发现,自噬在DN的发病机制中具有重要
球和肾小管基底膜增厚,系膜基质增多,最终导致作用[31-32],但目前尚不清楚PTEN、自噬与肾间质
肾小球硬化和肾小管间质纤维化[20]。在DN中,肾纤维化间的关系。Sun等[33]证实,抑制DN模型中
小管间质病变和间质纤维化一直备受关注[21]。高的miR-217可靶向调控PTEN表达,进一步恢复足
糖、蛋白尿和晚期糖基化终末产物具有固有的肾细胞自噬,从而拮抗足细胞损伤及胰岛素抵抗。
小管毒性,均可能触发间质性炎症并引起纤维化Guo等[34]发现,二氢杨梅素在治疗DN时,可通
反应,从而导致肾间质纤维化[22]。有研究发现,过抑制PI3K/Akt/mTOR通路增强自噬水平,调节
PTEN去磷酸化并激活肌动蛋白解聚因子cofilin-1,miR-155-5p/PTEN表达,从而缓解肾间质纤维化。
导致F-肌动蛋白形成,促进肥胖相关的肾小球足Chen等[35]在齐墩果酸治疗DN的研究中也发现,齐
细胞损伤引起肾小球病变[23]。通过抑制TGF-和墩果酸可通过抑制miR-142-5p促进PTEN表达和细
β
Notch信号通路,进而维持PTEN的表达,可有效减胞自噬,进而抑制HG诱导的NRK52E细胞纤维化。
缓UUO模型中的肾脏纤维化[24]。显而易见,PTEN可见,体外通过药物靶向提高PTEN和自噬相关蛋
在肾脏纤维化过程中扮演着重要角色。本研究观白的表达是治疗DN的关键点。本研究在高糖培养
察到高糖刺激NRK52E细胞后,胶原的表达增加并的近端肾小管上皮细胞中转染PTEN过表达质粒,
伴随PTEN的表达降低。以甘露醇作为高糖的渗透使用RFP-GFP-LC3双标腺相关病毒感染NRK52E细
控制剂,结果显示MA组PTEN蛋白表达水平与NG胞,并在各处理组加入100nmol/L的自噬诱导剂雷
组比较无变化,排除了高渗的影响,提示PTEN与帕霉素以提高整体自噬水平,便于更好地观察各组
肾小管间质纤维化存在一定的内在联系。有研究自噬流的动态变化,结果发现,与NG组比较,HG
发现,链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠存在明显的组红色斑点和黄色斑点数减少,HG+pPTEN组红色
PTEN蛋白下调,蛋白尿以及FN、-平滑肌肌动蛋斑点变化不大,黄色斑点数有所增加,而与HG组
α
白(-smoothmuscleactin,-SMA)和Ⅰ型胶原等纤比较,HG+pPTEN组红色斑点和黄色斑点数明显增
αα
维化因子增加,肾脏间质纤维化加重;利用芒果加,提示高糖刺激使自噬受到抑制,而高糖刺激后
苷治疗可预防肾间质纤维化,表现为FN、Ⅰ型胶过表达PTEN可恢复自噬水平。
原和-SMA阳性表达减少,同时上调PTEN,并降PTEN是一种肿瘤抑制基因,可负性调控磷
α
低PI3K和Akt的磷酸化,提示芒果苷可能通过上调脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素
PTEN,并降低PI3K和Akt的磷酸化途径抑制Ⅰ型胶(mTOR)途径[36]。mTOR信号传导图谱表明,mTOR
原、FN和-SMA的升高,从而减轻DN中的炎症和能通过调节关键细胞过程(包括蛋白质合成和自
α
氧化应激,最终抑制肾间质的纤维化[25]。然而,噬)来控制生物能量积累和代谢,而mTOR蛋白复
PTEN在糖尿病肾间质纤维化病理机制中如何发挥合体1可影响自噬激活激酶1和ATG13,抑制细胞
作用仍然不完全清楚。成分的自噬分解[37]。在DN肾间质纤维化过程中,
自噬是真核细胞周期中一个高度保守的过程,PTEN可能通过PI3K/Akt/mTOR通路,靶向调控
通过降解细胞质中的细胞器、蛋白质和大分子以及自噬的发生、发展。本研究发现,与NG组比较,
降解产物的循环,在细胞的生长、增殖和维持细胞HG组PTEN红色荧光减弱,胶原荧光染色增强,
环境的稳定性中发挥重要作用[26]。自噬功能失调可HG+pPTEN组PTEN染色有所恢复,胶原染色无明
能参与DN的发生发展[27]。肾脏细胞中基本水平的显变化,与HG组比较,HG+pPTEN组PTEN红色
自噬对维持肾脏内环境平衡必不可少,但在外界压荧光增强,胶原荧光染色减弱,提示高糖使细胞
力下自噬将发生改变,一旦自噬失调,可诱导急性PTEN表达降低、胶原表达增加,而过表达PTEN
及慢性肾病的发生。足细胞自噬、近端肾小管上皮可使高糖刺激下的自噬抑制被解除,并降低胶原的
细胞中线粒体自噬的改变将导致肾功能变化[28]。表达,因此,高糖培养近端肾小管上皮细胞转染
UUO模型中特异性敲除远端肾小管上皮细胞Atg7基PTEN过表达质粒后,可通过改变自噬水平缓解DN
440解放军医学杂志 2022年5月28日 第47卷 第5期
的纤维化进程。protectsagainstrenalfibrosisbysuppressingTGFβandNotch
综上所述,本研究发现,在DN的发生发展过signalingandpreservingPTENexpression[J].Theranostics,
2021,11(6):2706-2721.
程中,可通过恢复自噬缓解肾脏纤维化。然
PTEN[14]KlionskyDJ,
而,在高糖环境下过表达PTEN的干预实验中,我cellulardegradation[J].Science,2000,290(5497):1717-1721.
们没有进一步检测具体的PTEN蛋白、自噬相关蛋[15]ZhangHF,HuangZN,ChenW,
白、胶原的定量表达,并探讨更深层次的分子机reticulophagyanditsrelationshipwithdiseases[J].MedJChin
PLA,2021,46(12):1251-1257.[张慧芳,黄自能,陈蔚,
制,因而存在一定的局限性。PTEN的调控机制复
质网自噬及其与疾病的关系研究进展[J].解放军医学杂志,
杂,今后需要有更多研究去揭示PTEN在DN中的2021,46(12):1251-1257.]
调控作用,为PTEN用于DN的临床治疗提供理论[16]ZiminabA,ViktorovaEG,MoghimiS,
基础。ofpolioviruscapsidproteinswiththecellularautophagy
pathway[J].Viruses,2021,13(8):1587.
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