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网络出版时间:2022-9-2214:19 网络出版地址:.
Circ-101555经Wnt信号通路促进甲状腺癌的侵袭和
迁移
王德望1,2,夏 群1,戚庭月3,王成海1,3,4
摘要:目的 探讨circ-101555经Wnt信号通路促进甲状腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制。方法 收集79例甲状腺乳头状
癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)组织及癌旁正常甲状腺组织,应用RNA原位杂交技术检测circ-101555表达情况,并分析
其与PTC临床病理特征的关系。应用MTT法检测甲状腺癌细胞增殖活性;Transwell小室检测甲状腺癌细胞侵袭和迁移的能
力变化;双荧光素酶报告实验验证miR-1178对下游靶基因Wnt1的调控;Westernblot法分析circ-101555下游基因蛋白的表
达。结果 Circ-101555RNA在PTC组织中主要为阳性,而在癌旁正常甲状腺组织主要为阴性,PTC组织中circ-101555的阳
±,明显高于癌旁正常组织(±)(t=,P<)。Circ-101555表达与肿瘤局部浸润、淋
巴结转移及合并其他良性甲状腺疾病均密切相关(P均<),而与患者年龄、性别、发病部位、肿瘤大小、TNM分期和钙化
均无相关性(P均>)。MTT增殖活性检测表明:过表达circ-101555或敲低circ-101555对甲状腺癌细胞的增殖活性均无
明显变化(P>)。侵袭和迁移实验表明:与对照组[(±)个]相比,过表达circ-101555甲状腺癌细胞的侵袭数目
增多[(±)个],而敲低circ-101555甲状腺癌细胞的侵袭数目明显减少[(±)个];与对照组相比[(
±)个],过表达circ-101555后甲状腺癌细胞的迁移数目增多[(±)个],而敲低circ-101555甲状腺癌细胞的迁
移数目明显减少[(±)个],两组间比较差异均有统计学意义(P<)。生物信息学预测并通过qRT-PCR实验验
证miR-1178是circ-101555的下游靶基因;通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-1178与Wnt1的结合具有特异性,Wnt1是
miR-1178的直接靶基因。Westernblot和回复实验结果表明:无论circ-101555和miR-1178如何变化,Wnt1、β-catenin和MMP-
9都受circ-101555的调控。结论 甲状腺癌中circ-101555抑制了miR-1178表达,进而激活Wnt信号通路促进甲状腺癌的侵
袭和迁移,可为circ-101555治疗转移性PTC提供理论依据。
关键词:甲状腺肿瘤;circ-101555;miR-1178;Wnt通路;迁移与侵袭
中图分类号: 文献标志码:A 文章编号:1001-7399(2022)09-1083-07
doi:.
甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤之
接受日期:2022-05-16一[1],其主要病理类型是甲状腺乳头状癌(papillary
基金项目:2019江苏省卫生健康委科研项目(Z2019046)、2020扬州thyroidcarcinoma,PTC)[2]。基因突变和环境因素
市科技计划项目(YZ2020099)
在甲状腺癌的发生、发展中起重要作用[3-4]。目前,
作者单位:1扬州大学医学院病理学教研室,扬州 225009
2广东医科大学附属东莞第一医院病理科,东莞 523710甲状腺癌的发病机制尚不清楚。环状核糖核酸(cir-
3扬州大学附属医院超声科,扬州 225012cularribonucleicacid,circ-RNA)是一类非编码
4江苏省中西医结合老年病防治重点实验室,扬州 RNA,其参与多种肿瘤的增殖、凋亡和转移等生物学
225009过程[5-7]。本实验利用NCBI在线数据集
作者简介:王德望,男,硕士,副主任医师。E-mail:******@qq.
(GSE93522)分析得到PTC差异表达的circ-RNAs,
com
王成海,男,博士,主任医师,通讯作者。E-mail:chwang@其中circ-101555表达升高,本实验旨在探讨circ-
、发展过程的影响。
-upfor7-33monthsshowedthat4caseshadaccompaniedbyintra-andextra-thyroidallymphaticvascular
-TRKimmunohistochemicalstainingcombinedwith
TheclinicalmanifestationsofNRPTCareBRAFV600Emutationstatuscanbeusedasaprimaryscreening
aggressive,withahighrateoflymphnodemetastasis,anddis-methodforNRPTC.
,mostofKeywords:papillarythyroidcarcinoma;NTRK-rearrangedpa-
themshowinfiltrative,multinodulargrowth,mainlyfollicularpillarythyroidcarcinomas;immunohistochemistry;clinicopatho-
structure,
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mL至Transwell小室上室内,下室内添加有血清的
1 材料与方法
,置于培养箱内孵育24h。将小室取
临床标本 收集2018年10月~2020年10月出,棉签擦掉基质胶及没穿膜的细胞,用PBS洗涤,
扬州大学附属医院行甲乳外科手术的79例新鲜95%乙醇固定15min,结晶紫染色。随机选择5个
PTC组织和邻近正常甲状腺组织,患者年龄36~79光镜视野,统计细胞迁移数量。(2)细胞侵袭实验:
岁,中位年龄58岁;男性30例,女性49例。所有患肿瘤细胞用无血清细胞培养液制备成单细胞悬浮
者手术前均未行放、化疗。标本使用及临床资料收液。把Matrigel放在4℃冰箱过夜融化,吸取50μg
集均经扬州大学医学院伦理委员会批准,并与患者Matrigel添加到95μL无血清细胞培养液内,将稀释
签署知情同意书。新鲜标本采集后立即放入液氮罐后的Matrigel添加到Transwell小室内,转移到37℃
里,于-80℃冰箱内保存,已备后期实验使用。孵育1h。后续实验过程和细胞迁移实验相同。
材料与细胞 生物信息学预测circ-101555的下游靶基因及
和CM-H023培养基,购于武汉Procell公司。PTC细验证 Circ-101555和miR-1178的下游靶基因预测
胞株B-、-
所细胞库。PTFE在CM-H023培养基中培养,-
细胞株在RPMI-1640培养基中培养,,miR-1178下游靶基因的有效验证通过双
G(100U/mL)、链霉素(100mg/mL)和10%胎牛血荧光素酶报告基因实验。
清。所有细胞系均在37℃、5% Westernblot法检测蛋白表达 肿瘤细胞培
培养。MMP-9抗体购自武汉博士德生物公司;Wnt1养24h,分别在细胞中加入含1%PMSF的RIPA溶
抗体购自美国Abcam公司。Circ-101555过表达和液,置于冰上裂解30min,转至离心管内,以4℃
敲低质粒由上海生工生物公司合成。转染试剂盒12000r/min离心15min,吸取上清,测定蛋白浓度
Lipofectamine2000购于Invitrogen公司,转染步骤按并标记、分装。SDS-PAGE凝胶电泳采用10%分离
试剂盒说明书进行。胶、5%浓缩胶。把2×LoadingBuffer添加到蛋白溶
qRT-PCR检测 总RNA提取试剂盒分离肿液中,100℃孵化5min。每个上样孔中均加入30
瘤组织或细胞后,用cDNA第一链合成试剂盒进行μg蛋白样品,70V电泳,观察染料到达分离胶时,
逆转录,再用2×TaqPCRMasterMix进行qRT-PCR。调整电压为100V继续电泳,观察溴酚蓝到达凝胶
详细步骤按试剂说明书进行。下端时,终止电泳。把凝胶取出,裁剪合适大小的
RNA原位分子杂交实验 Circ-101555RNANC膜,放在转移缓冲液中浸泡备用。设置200mA
探针和原位杂交试剂盒购于武汉BOSTER生物公恒流、冰上转膜50min。把NC膜置于5%牛血清白
司。实验步骤按试剂说明书进行杂交结果判定标蛋白内,于室温下孵育2h。将一抗溶液(1∶1000)
准:细胞中出现棕黄色物质为circ-101555阳性细放入NC膜,4℃冰箱孵化过夜。次日将二抗
胞;光镜下随机选择5个高倍视野,计算阳性细胞与(1∶4000)浸泡NC膜,37℃孵育2h,按照ECL方
总细胞数的百分率,<1%为阴性,1%~100%为阳法显色。将GAPDH设置为参照,分析条带的灰度
性。实验设阳性对照,不加探针的染色组织为空白值,以灰度值计算蛋白表达水平。
对照。 统计学分析
MTT检测细胞增殖活性 ,计量数据
期的肿瘤细胞,按4×104/mL的密度接种到96孔用x-±s表示,组间均数的比较采用t检验,计数资料
板,每孔100μL,培养24h,在每孔内添加10μL采用频数和频率指标进行描述,组间比较采用χ2检
MTT溶液,继续温箱孵育2h。吸弃孔中液体后添验,以P<。
加150μL二***亚砜,孵育10min,立即用酶标仪
2 结果
测定每孔在450nm处的OD值,以OD值表示细胞
增殖活性。 PTC组织中circ-101555的表达 RNA原位
Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力杂交实验结果表明:79例PTC组织中circ-101555
(1)细胞迁移实验:肿瘤细胞用无血清细胞培养RNA主要定位于细胞质中,染色为大小不等、着色
液制备成单细胞悬浮液。(图1A);其
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在癌旁正常甲状腺组织中未出现棕黄色颗粒,呈阴表1 PTC组织中circ-101555表达与临床病理特征的关系
circ-101555
性(图1B)。PTC组织中circ-101555的阳性比值为临床病理参数nχ2值P值
阳性阴性
±,明显高于癌旁正常组织(±
年龄(岁)
),两组间比较差异有统计学意义(t=,P <45322210

<)。 ≥4547389
性别
男26215

女533914
发病部位
左叶+右叶624814

双叶+峡部17125
合并其他
甲状腺疾病
有30255

无493514
肿瘤直径(cm)
<132248

≥1473611
图1 RNA原位杂交检测circ-101555RNA的表达:
circ-101555RNA呈阳性,细胞中出现棕黄色颗粒; 有43376

腺组织中呈阴性,细胞中未出现棕黄色颗粒 无362313
淋巴结转移
PTC中circ-101555表达与临床病理特征的
有46397

关系 在79例PTC组织中,根据阳性细胞百分率 无332112
分为circ-101555阳性组(1%~100%)和circ-TNM分期
Ⅰ+Ⅱ513813
101555阴性组(<1%)。circ-
Ⅲ+Ⅳ28226
部浸润、淋巴结转移、合并其他良性甲状腺疾病均密钙化
切相关(P均<),而与患者年龄、性别、发病部 有43358

位、肿瘤大小、TNM分期和钙化均无相关性(P均> 无362511
,表1)。
Circ-101555对甲状腺癌细胞增殖活性的影响表2 circ-101555对甲状腺癌细胞增殖活性影响
与对照组相比,过表达circ-101555及敲低circ-时间OD值
(h)过表达circ-101555组对照组敲低circ-101555组
101555组甲状腺癌细胞的增殖活性变化差异均无
±±±
统计学意义(P>,表2)。这提示circ-±±±
对甲状腺癌细胞的生长和增殖无明显影响。±±±
Circ-101555对甲状腺癌细胞迁移和侵袭的影P值>*>*
响 Transwell实验结果表明:与对照组相比[( 同一时间点上,与对照组相比,*P>
±)个],过表达circ-101555甲状腺癌细胞的侵
袭数目增多[(±)个],而敲低circ-101555context+scorepercentile>95分,仅miR-1178符合
甲状腺癌细胞的侵袭数目明显减少[(±上述条件。同时调整circ-101555表达后miR-1178
)个]。与对照组相比[(±)个],过表达也随之变化(图3),提示miR-1178是circ-
表达circ-101555甲状腺癌细胞的迁移数目增多101555的下游靶基因。对miR-1178的编码RNA预
[(±)个],敲低circ-101555甲状腺癌细测得到Wnt1的3′UTR有miR-1178种子序列的结
胞的迁移数目明显减少[(±)个]。两组合位点。通过双荧光素酶报告基因实验得出在
间比较差异均有统计学意义(P<,图2)。Wnt13′UTR野生型转染组,miR-1178高表达可明
Circ-101555下游靶基因的预测及验证 预测显抑制相应的荧光活性,而在突变组miR-1178中未
circ-101555的下游miRNA包括miR-324、miR-1178、有这种抑制作用(图4)。因此miR-1178与Wnt1的
miR-1182和miR-1208,根据结合位点数目>7个且结合具有特异性,Wnt1是miR-1178的直接靶基因。
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图2 Circ-101555对甲状腺癌细胞迁移和侵袭的影响
状腺癌细胞的Wnt信号通路,促进甲状腺癌细胞的
侵袭、迁移(表3,图5、6)。
3 讨论
甲状腺癌起源于甲状腺滤泡上皮细胞或甲状腺
滤泡旁细胞。近年甲状腺癌的发病率呈上升趋势,
而病死率较为稳定[8]。甲状腺癌组织学类型有5
种,其中80%的类型是PTC[4]。甲状腺癌以手术治
图3 Circ-101555对miR-1178表达的影响:过表达circ-101555后
[9]
miR-1178表达水平下降,敲低circ-101555后miR-1178的表达水平疗为主,其次辅助放射性碘治疗。转移、复发和
升高;*P<,往往是甲状腺癌患者死亡的主
要原因[3]。目前,甲状腺癌的发病机制尚不清楚,
Circ-101555对甲状腺癌细胞中Wnt信号通深入研究甲状腺癌的发生、发展机制,有助于提高患
路和侵袭迁移的影响 回复实验结果表明:改变者的预后。
circ-101555和miR-1178表达对PTC细胞侵袭、迁 在PTC研究中circRNA被广泛用作miRNA海
移的影响以及Wnt信号通路中Wnt1、β-catenin和绵来调节下游的靶基因,影响癌症的发生、发
MMP-9蛋白的变化,结果显示circ-101555能促进甲展[10-11]。例如,circ-58124作为一个新的致癌基因
图4 ′UTR(455~449位)与miR-1178种子序列(1~7位)有直接的结合位点;′
UTR的关系图;′UTR质粒与miR-1178共转染后B-CPAP细胞荧光素酶的相对活性:在Wnt13′UTR野生型(wt
Wnt1)转染组,miR-1178高表达可明显抑制相应的荧光活性,而在突变组(mutWnt1)miR-1178未有这种抑制作用,NC为对照组,*P<
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表3 甲状腺癌细胞侵袭和迁移数目、Wnt1、β-catenin和MMP-9蛋白水平
组别侵袭数目(个)迁移数目(个)Wnt1β-cateninMMP-9
±±±±±
±*±*±*±*±*
±*±*±*±*±*
±±±±±
±±±±±
±*±*±*±*±*
±*±*±*±*±*
;-101555过表达组;-101555敲低组;-101555+miR-1178过表达组;-101555+miR-1178敲低组;-
101555过表达+miR-1178敲低组;-101555敲低+miR-1178过表达组;与对照组(NC)比较,*P<
图5 Transwell实验显示circ-101555调控miR-1178促进甲状腺癌细胞侵袭、迁移:;-101555过表达组;-101555敲低组;
-101555+miR-1178过表达组;-101555+miR-1178敲低组;-101555过表达+miR-1178敲低组;-101555敲低+miR-1178
过表达组
子,当Wnt信号通路被激活,两者表达水平升高[16],
它们在能量代谢、氧化应激、炎症、细胞增殖等生理
过程中发挥重要作用[17]。研究表明在肿瘤组织中
Wnt信号通路被过度激活,从而对肿瘤细胞的进展
发挥促进作用,比如Wnt信号激活促进胃癌细胞增
图6 Westernblot实验显示circ-101555调控miR-1178对Wnt信殖迁移和增加EMT水平,而抑制Wnt信号可降低胃
号通路的影响:;-101555过表达组;-101555癌细胞生长和转移能力[18]。CircRNA-102171在
敲低组;-101555+miR-1178过表达组;-101555+miR-
PTC中表达上调,其与CTNNBIP1相互作用,阻断它
1178敲低组;-101555过表达+miR-1178敲低组;-101555
敲低组+miR-1178过表达组与β-catenin/TCF3/TCF4/LEF1复合物的相互作用,
导致Wnt/β-catenin通路的激活,促进PTC细胞的
与PTC患者恶性特征及预后不良有关,其抑制增殖、迁移和侵袭[19]。Circ-ITCH能吸附miR-22-3p
NOTCH3/GATAD2A信号轴促进PTC细胞的增殖、上调CBL的表达,从而抑制Wnt/β-catenin通路的
侵袭和转移[12]。Circ-102002在PTC组织和细胞中激活,减缓PTC进展[20]。本实验结果显示:circ-
表达上调,海绵miR-488-3p促进HAS2过表达可以101555通过抑制miR-1178表达升高甲状腺癌细胞
恢复受抑制的上皮-间质转换和迁移[13]。Circ-中Wnt信号通路Wnt1和β-catenin蛋白水平,从而
HIPK3通过吸附miR-338-3p,上调其靶基因RAB23促进了甲状腺癌细胞的侵袭和迁移,提示
的表达,从而促进甲状腺癌的发生和侵袭性[14]。敲circ-101555也是Wnt信号通路的激活剂。
除circ-0067934可抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移和肿瘤细胞在转移至新的组织和器官时,能合成
侵袭[15]。本实验结果表明,circ-101555能调控大量的细胞外基质降解酶,破坏细胞外基质结构,为
miR-1178的表达,发挥其microRNA海绵作用,从而肿瘤的侵袭和迁移提供条件[21]。研究表明Wnt信
激活Wnt信号通路。号通路能调控MMP-9的表达[22],MMP-9是常见的
Wnt1和β-catenin是Wnt信号通路中的关键分细胞外基质降解酶,能降解细胞外基质,为肿瘤的侵
·1088·临床与实验病理学杂志 JClinExpPathol 2022Sep;38(9)
袭和远处转移提供必要的条件[23]。本实验发现[11]ChenF,FengZ,ZhuJ,
circ-101555激活Wnt信号通路中Wnt1和β-catenintargetingmiR-370-3pintheproliferationandinvasionofthyroid
cancerviaWntsignalingpathway[J].CancerBiolTher,2018,19
的蛋白水平后,MMP-9的含量增加,癌细胞周围的
(12):1139-1152.
基质降解,增加了基质间隙,促进癌细胞的入侵和转[12]YaoY,ChenX,YangH,-
移。这一结果说明MMP-9会被不同的信号通路激pillarythyroidcancertumorigenesisandinvasivenessthroughthe
活,从而促进癌细胞侵袭和迁移,本实验结果与文献NOTCH3/GATAD2Aaxis[J].JExpClinCancerRes,2019,38
报道一致。(1):318.
[13]ZhangW,LiuT,LiT,
综上所述,circ-101555通过下调miR-1178表达
metastasisofpapillarythyroidcancerthroughregulatingmiR-488-
后激活Wnt信号通路中Wnt1、β-catenin和MMP-93p/HAS2axis[J].CancerGeneTher,2021,28(3-4):279-
的表达水平,从而促进甲状腺癌细胞的侵袭和迁移,293.
为研究circ-101555抗甲状腺癌作用机制提供了数[14]ShuT,YangL,SunL,
tumorigenesisandinvasionthroughtheMirna-338-3p/RAB23Axis
据,为今后诊断和治疗甲状腺癌提供有力的理论基
[J].MedPrincPract,:.
础。
[15]WangH,YanX,ZhangH,-
pressioncorrelateswithpoorprognosisandpromotesthyroidcarci-
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