病毒及其疫苗生产制备技术.doc

该【病毒及其疫苗生产制备技术 】是由【泰山小桥流水】上传分享，文档一共【7】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【病毒及其疫苗生产制备技术 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
第25章病毒及其疫苗的生产制备技术
第一节病毒的生产制备
病毒需在活的敏感细胞中才能增殖,在细胞培育技术不行熟从前,人们为研究病毒,往
往采纳鸡胚接种或动物接种的方法来分别、判断病毒或制备必定量的病毒液,但这类方法因
个体和种属差异,不但好多病毒难以找到适合的敏动人物,并且即使在敏动人物中生殖,往
往个体差异大而影响结果的判断,跟着细胞培育技术的发展,第一在病毒学研究方面获取了
广泛的应用,为病毒的生殖、判断供给了来自不一样动物(包含人)、不一样组织的细胞本源,
经过敏感性挑选,目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞,为病毒的分别、判断和增殖创
造了条件。同时也为病毒的大批生产供给了细胞本源,跟着细胞大批生产技术的发展,所以
对病毒来说只要有敏感的细胞,就可以进行大规模生产。
一、病毒生产的目的和用途
1、为了制备大批的病毒抗原,以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗,或用病毒抗原制备免疫血清(抗体)。
2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗,以用于预防接种。
3、为了生产基因改造后或重组有其余多肽因子的病毒,以用于基因治疗或杀肿瘤治疗
及基因疫苗的预防接种。
4、为了制备搅乱素的病毒诱生剂(NDV、仙台病毒等),用于搅乱素的生产。
5、生物战用的病毒生物战剂。常采纳毒力强、抵抗力强、对不一样国家人群最敏感的病
毒,又能经过气溶胶或昆虫和污染的水土进行流传的病毒。这是战争狂们正在睁开的研究,
应警惕。
二、病毒生产制备的方法
1、动物接种,如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采纳鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。
2、鸡胚、鸭胚接种:如流感病毒、副流感病毒(NDV-F)、仙台病毒等,目前还没有敏感
细胞,常采纳9~10日胚龄的尿囊腔接种,37℃孵育72小时收获尿液,用鸡红血球测定血
凝效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊,马脑炎病毒常采纳10日龄鸡胚体
接种,收获全胚体液等。
3、细胞培育法(详见第二篇第18章)
不一样的病毒采纳相应的敏感细胞,采纳转瓶培育、多层培育、微载体培育或悬浮搅拌培
养等方法,先大批增殖细胞,而后接种必定量的病毒,连续培育适合时间时,冻融细胞后,离
心收获上清。
以上病毒大批生产后可制作病毒疫苗(死疫苗或减毒活疫苗),也可用来作搅乱素诱生剂或提取病毒表面抗原成分,但反对用作生物战剂,危害人类健康和生命。
第二节病毒疫苗的生产制备
病毒疫苗的生产制备与病毒的生产制备基真同样,目行进行人工主动免疫,用于病毒病
预防的疫苗有灭活疫苗(KilledVaccine),又称死疫苗,减毒活疫苗(LiveVaccine),亚单位疫苗,多肽疫苗、基因缺失的减毒活疫苗,基因工程亚单位疫苗,重组牛痘多价疫苗。
一、病毒疫苗的种类
(一)灭活疫苗:目前常用的有流行性乙型脑炎疫苗,狂犬病疫苗(二倍体细胞与地鼠肾
细胞可用于生产狂犬病病毒固定毒灭活疫苗),流感灭活疫苗。常用甲醛为灭活剂,以灭活
病毒核酸而不影响其抗原性。
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
(二)减毒活疫苗,平时采纳自然法或人工法,经过动物传代或细胞传代挑选对人毒力低的变异株病毒。常用的有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流感温度敏感突变株疫苗、

流行性腮
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗以及一些联合疫苗(如麻疹、腮腺炎、风疹联合疫苗)

。
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
(三)亚单位疫苗:用化学试剂裂解病毒,提取包膜或衣壳上的亚单位,除掉其核酸,以此制成的疫苗称亚单位疫苗。如流感病毒的包膜提取后制成的血凝素和神经氨酸酶亚单位疫
苗。
(四)多肽疫苗:采纳乙肝携带者血提取的HBsAg的乙型肝炎疫苗或采纳基因工程法制备的HBsAg基因表达产物制备的疫苗。
(五)基因缺失的减毒活疫苗:在病毒的基因组中,使其有毒力的相关基因发生缺失而制
成的减毒活疫苗称基因缺失的减毒活疫苗,如狂犬病毒的胸苷激酶(TK)缺失株(第一代)
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
和gp3区缺失株(第二代),单纯疱疹病毒的α

22基因缺失株,目前有待进一步研究。
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
(六)基因工程亚单位疫苗:将病毒表面抗原基因,经过基因重组,在酵母或CHO细胞中进行表达亚单位多肽抗原成分而制成的疫苗,称基因工程亚单位疫苗,如乙型肝炎病毒的表
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
面抗原

HBsAg的基因在酵母和

CHO细胞中表达而提取获取的纯品

HBsAg多肽。马上上市。
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
(七)重组牛痘多价活疫苗。以牛痘苗为载体来表达数十种外源性病毒抗原基因,

如:HAV、
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV,狂犬病毒等抗原基因,经基因重组后而制成的牛痘
苗病毒,经一次划痕接种可使机体同时能获取对多种病毒的免疫力,大大减少了接种次数。其余腺病毒和脊髓灰质炎病毒的活疫苗也可作为载体与轮状病毒的抗原基因重组后的活疫苗,经口服后可同时获取两种病毒的免疫力,有待于进一步研究、开发。
上述病毒疫苗有的是采纳细胞培育技术和细胞工程来进行生产制备的,现将采纳细胞工程制备病毒疫苗种类和敏感细胞以及生产方式规于下表。
二、细胞培育法制备的常用疫苗(如表25-1)。
表25-1采纳细胞培育法生产的常用病毒疫苗
疫
苗
制备疫苗
培育方法
名
称
活/死(疫苗株)
的细胞
脊髓灰
灭活(Salk株)
猴肾细胞(原代/2-3代)
转瓶培育
质炎疫苗
活(Sabin株)
Vero细胞
微载体培育
腮腺炎
活(ME株)
幼地鼠、狗肾
转瓶培育
疫
苗
豚鼠肾细胞
罗氏瓶培育
Edomonste、
原代鸡胚纤维母
L16、沪191、
细胞,人二倍体
罗氏瓶培育
麻疹活疫苗
Moraten、
人羊膜、狗肾、羊肾
转瓶培育
Schwar2株
豚鼠肾细胞
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
单纯疮疹
兔肾、豚鼠肾
罗氏瓶培育
病毒疫苗
死(72株)
转瓶培育
豚鼠胚成纤维细胞
巨细胞病毒疫
活(Towne株)
WI-38人胚肺细胞
转瓶培育
苗
狂犬病毒疫苗死(AV01/AV02株)人二倍体细胞微载体培育
CUS株)
流行性乙型
灭活(5-3株)人二倍体细胞多层滋润增殖器
脑炎疫苗
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
丛林脑炎
病毒疫苗

灭活

鸡胚纤维母细胞
幼地鼠肾细胞

转瓶培育
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
三、用细胞培育制备病毒疫苗的长处:
病毒疫苗的制备开始多用动物脏器、禽类胚胎(第一代疫苗)。可是因本源困难,很不经济,制作麻烦,数目受限,更危险的是这些组织中间可能含有潜伏致癌病毒和慢性病毒,
后改用原代细胞来制作疫苗(第二代疫苗),如麻疹疫苗、乙脑疫苗等,跟着细胞培育的发展,特别是自70年代后我国二倍体细胞株接踵建立,为疫苗生产创立了极为有益的基础,这比用原代细胞制备疫苗更优胜。如:
1)在细胞传代时期可进行比较全面的检查,特别是对潜伏病毒和致癌性的检查,保证安全。
2)可使逐渐适应于无血清(或无蛋白)培基中生产生殖,以消除过敏要素。
3)可优选对病毒敏感的细胞克隆。以利病毒在细胞中大批增殖,有助于疫苗产量的
提升。
4)易于大批生产和进行连续自动化工业生产,以满足量的需求。
外国已建立的二倍体细胞WI-38、MRC-5、IMR-90等,国内已建立KMB-17、2BS、SL-7
等均已用于疫苗生产,如麻疹活疫苗、乙型脑炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、腮腺炎疫苗等,从
目前发展来看,用二倍体细胞制备疫苗将有代替其余原代细胞和传代细胞的趋向,但目前仍
有一些病毒疫苗的制备还需用原代细胞,最近几年来有人主张用肿瘤细胞制备人用灭活疫苗。
四、提升疫苗的效劳常采纳的方法:
(1)细胞的药物办理:用某些药物办理细胞后可以刺激病毒生殖(以下表),其方法为:在
细胞形成单层后,用一些化学药物来办理,而后洗去,再接种病毒,即可使病毒提前成熟,产量高,现列表以下:
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
办理细胞的药物
5-碘-2-脱氧尿核甙
维生素A或Tween-80

刺激的病毒
风疹、腺病毒、巨细胞病SV-40
脊髓灰质炎病毒、滤泡性口腔炎病毒
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
胆固醇或卵磷质
脊髓灰质炎病毒
DEAE-dextran
脊髓灰质炎病毒、风疹痘类病毒,付流感病毒
胰
酶
痘类病毒、呼吸道肠道病毒,流感病毒、鼻病毒
二甲亚砜
脊髓灰质炎病毒、流感、疱疹病毒
放线菌素D
麻疹、脊髓灰质炎病毒、付流感病毒
(2)在保持液中增补某些物质也有益于某些病毒的复制、列表以下:
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
增添的药物

刺激

的病

毒
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
Tween-80或油酸钠
谷氨酰***
精氨酸
脯氨酸、赖氨酸

乙型脑炎
麻疹、脊髓灰质炎病毒、仙台病毒
痘类病毒、疱疹病毒
乙型脑炎
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
3)毒种的选择:经过空斑优选产量高的大空斑毒株,精制毒种可提升病毒产量。
4)病毒液的浓缩:经浓缩后,病毒浓度增高,从而效价也随之上升。五、影响疫苗质量的要素:
1)毒种:毒种的好坏不但影响疫苗的产量,并且也影响疫苗的质量,毒种不纯会产
生互相搅乱,减毒活疫苗毒种若毒力上升易造成事故,所以毒种的选择应优选那些致病性低,
免疫效价高而长远,抗原谱广的,易增殖,便于生产,可在传代细胞上传代的毒种。
2)培育病毒的细胞:细胞如有潜伏的致癌性病毒或慢病毒,以及有支原体污染均不可以用作疫苗生产。对此要素应严格检查。其余若细胞自己发生转变后,不宜于制备活疫苗,只好制备一些灭活疫苗或亚单位疫苗。
3)培育液:培育细胞的营养液中多少含有必定量的血清蛋白,在疫苗使用中常会出
现某种程度的过敏反应,为此,应尽量使细胞适应于无血清蛋白的培育基中,以除掉过敏源。
4)甲醛灭活剂的使用:甲醛能使病毒灭活,但仍保持其抗原性,所以广泛用来制备灭活病毒疫苗,但要控制含量。
病毒被灭活的程度与灭活的温度和甲醛的浓度等要素有亲近关系。一般用热灭活的方法,采纳在37℃灭活一准时间。经热灭活疫苗,不仅其免疫原性、免疫效劳和稳固性不受影响,并且灭活病毒的温度提升今后,灭活时间相对可以缩短,灭活剂的用量也可以减少。
甲醛能刺激局部而引起痛苦和红肿,并有开释组织***的作用。所以制备疫苗时减少甲醛
浓度是必需的。假如疫苗内游离甲醛含量降低到必定程度后,可考虑不需再用亚硫酸氢钠来中和甲醛。这对减少注射后痛苦及便于推行预防接种有重要意义。
六、生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法
(一)制备工艺流程
(1)脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
猴肾细胞培育
←接种病毒(测0%正常细胞比较)
收获病毒,合并,加MgCl2→
无菌试验→←猴病毒检查(获肾细胞)(SV40)
B病毒检查(兔肾细胞)→←病毒效价滴定
←合并,过滤加MgCl2
←无菌试验
分亚批→←柯萨奇病毒检查(乳鼠)
病毒滴定→←型特异性检查
B病毒复检(家兔)→←T特色试验
分装病毒滴定→←猴体节余致麻痹力试验
(安全试验)病理切片
结核杆菌检查→
分装→←无菌试验
病毒滴定→
→保存于-20℃待检定合格后
加工糖丸
脊髓灰质炎活疫菌工艺流程
2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺
地鼠肾
剪碎,胰酶消化
地鼠肾细胞悬液
37℃,3天细胞培育液,~
单层细胞
清洗细胞,去除牛血清
10-4~10-5浓度病毒感染细胞
32~34℃培育2~3天
收获病毒液(收二次)
按1:2000加入甲醛
22℃,8天
灭活病毒液
合并,安全及效劳试验
原液
加入亚硫酸氨钠
半成品
分装
成品
检定(包含理化性质,无菌试验、安全试验,
防腐剂、试剂及节余牛血清含量等)
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
合格成品
(二)生产方法:
病毒和病毒疫苗的生产方法基真同样,其规模取决于细胞生产规模,所以上述介绍的细
胞大批生产的方法和工艺均可用来生产病毒和病毒疫苗,可依据需要及适合生产条件来采纳培育装置,如转瓶培育,因设备简单,便于生产单位采纳。而多层培育,微载体培育,目前
外国已用于生产,我国仍在研究中。悬浮搅拌培育的简单装置已应用于疫苗生产,全自动悬浮发酵罐,在搅乱素生产中有应用,但在疫苗生产中正在试用,下边侧重介绍微载体培育法生产病毒的技术。
1、微载体悬浮培育细胞的病毒生产工艺
作者选VSV病毒来接种经微载体培育的敏感细胞,病毒的效价测定用
A549细胞(也可
用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID50
50
),病毒的效价为6Log
TCID/mL,
用鸡胚细胞空斑法测定一般为107Pfu/mL。
①VSV在方瓶贴壁细胞中的增殖(100mL方瓶,10mL培育基)待BHK21、BHK13、CHO-K1
细胞长满单层,弃上清加入
10-2VSV病毒悬液,
37℃吸附1小时,加病毒保持液培育
20小
时,于-30℃冻存,待测效价。
②VSV在微载体悬液培育的细胞中增殖。
微载体培育的BHK21或BHK13、或CHO-K1细胞,
3~4天后细胞密度已达1
×106细胞/mL
静置30分钟
尽量吸去原培育基
37℃
将10-2VSV病毒按50mL培育体积加入1mL病毒液于微载体细胞中
37℃50r/min搅拌5分钟
静置吸附1小时(每20分钟搅拌2分钟)
加入病毒保持液至原体积
37℃连续搅拌培育20小时
于-30℃冻融后
2000r/min低温离心10分钟
采集上清,即为VSV增殖的病毒液,分装冻存,待测效价
结果,在微载体悬浮培育的三株细胞所生殖VSV病毒不但产量大,并且病毒效价均匀高1LogTCID50,尤以CHO-K1效价最高,均匀可达比原来的毒种效价还要高,又起到了提升病毒
效价的作用。
此方法也可应用于生产病毒疫苗,只要疫苗株病毒的敏感细胞能在微载体上大批生产。
若疫苗株是减毒活疫苗株,此法生产的病毒可直接制备活疫苗。若疫苗株为非减毒活疫苗株,
此法生产的病毒可用甲醛灭活法制备死疫苗。
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
2、转瓶培育法
此法是目前各大生物制品研究所常用于生产疫毒疫苗的方法,如生产脊髓灰质炎病毒疫
苗,麻疹疫苗等。
将细胞制备成悬液后,在温室内(37℃)使支架以8~12转/小时缓慢转动,以使细胞
贴壁,当加入病毒后,待细胞出现+++以上细胞病理性改变(CPE)时,标记病毒已大批生殖,
此时收获病毒,按生物制品程序加工成疫苗。
3、罗式瓶培育
将好多大罗氏瓶,在净化室内,把制备好的细胞悬液人工加入瓶内,100mL/瓶,在温室
内的货架上一排排搁置,进行静置贴壁培育,待细胞呈单层后,倒去旧液,加含病毒疫苗株
和保持液,连续静置培育,每天观察细胞和记录温室的温度,待细胞有明显的CPE产生时,
收获病毒液,而后按疫苗生产加工工艺制成疫苗。
以上2、3两种方法是我国各大生物制品所老例方法,因为制品工艺的要求,目前依旧
采纳,但正在千锤百炼和采纳新工艺、新方法和高技术来生产疫苗。
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术
病毒及其疫苗的生产制备技术