氯化钙法质粒转化.doc

***化钙法质粒转化
***化钙法进行质粒转化
利用冰冷的CaCl2 petent cells,以传统方法进行质体的转形。仪器用具:37℃培养箱;42℃水浴;冰浴
药品试剂:
M CaCl2置冰浴中
2 M glucose:
取18 g glucose溶于水中,并调体积至50 mL,无菌过滤,分装后置-20℃贮存。
2 M Mg2+:
g MgCl2 · g MgSO4 · 7H2O溶于水中,并调体积至100mL,无菌过滤的,分装小瓶置-20℃贮存。亦可以MgCl2完全取代MgSO4.
SOB 液体培养基:
32 Methods in Biotechnology Vol 1
2% Bacto tryptone, % yeast extract, 10 mM NaCl, mM KCl,高压灭菌,使用前加入2 M Mg2+,使最终浓度为10 mM.
SOB 固体培养基:
2% Bacto tryptone, % yeast extract, 10 mM NaCl, mM KCl, % Bactoagar,高压灭菌,倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM.
SOC/Amp 固体培养基:
SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin.
SOC 液体培养基: SOB 中加入20 mM glucose (使用前加入)。大肠杆菌菌株: JM109
#1~#5 接合反应液
方法步骤:
1) 进行转形实验前16~20 h,自-70℃取出贮存的菌种,以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上,在37℃培养。
2) 取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶(请记得加入Mg2+)。另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB中,震荡将菌体打散后,加入40 mL SOB中,于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计
3) 收集菌液于离心管中,置冰浴中10~15 min.
4) 以750~1,000 g 离心12~15 min (4℃)。
5) 倒去上清,并尽量将液体倒干,或以微量移液器头吸干净。
6) 沉淀加入1/3 M CaCl2,稍加震荡,混合均匀,置冰浴中10~15 min.
7) 同上4), 5) 的操作。再重复6), 4), 5) 的操作,以使反应更完全,增加成功率。
8) 加入1/25 M CaCl2,稍加震荡使混合均匀。
◆ Competent cells 制备完成!
9) DNA 样品(<10 μL) 先装于微量离心管中,置冰浴中预冷,
另取一微量离心管,标上#0,不加入任何DNA (作为negative control),亦置冰浴中预冷。
每个样品加入200 μL 菌液,震荡混合后,置冰浴中20~40 min.
10) 42℃加热90 s (温度及时间均需很准确,请事先检查水浴