禽源鹦鹉热衣原体活载体疫苗的制备方法.docx

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专利名称:禽源鹦鹉热衣原体活载体疫苗的制备方法
技术领域:
本发明涉及一种禽疫苗的制备方法及其疫苗。确切讲本发明涉及禽源鹦鹉热衣原体活载体疫苗的制备方法,以及疫苗。
背景技术:
禽衣原体病(AvianChlamydiosis,AC)是由鹦鹉热嗜性衣原体(Chlamydophilapsittaci)感染禽类引起的一种接触性传染病。目前禽衣原体病又叫做鹦鹉热。后来,“鸟疫”一词被引入,主要用来区别鹦鹉以外的鸟类感染的AC。实际上,从鹦鹉及非鹦鹉鸟类分离出的致病性衣原体株可以交叉感染,引起同样的疾病。
鹦鹉热衣原体是一种严格细胞内寄生的微生物,目前研究清楚的有8个血清型,其中至少6个血清型(A、B、C、D、E、F)感染大多数宠物鸟、家禽、野鸟。值得注意的是这些禽血清型通过禽类感染人类。在二十世纪初,流行玩赏鹦鹉,鹦鹉鸟感染鹦鹉热衣原体后传染给玩赏者,结果引起人的衣原体流行,在美洲、欧洲和非洲有数百人的死亡,在当时引起很大的恐慌。
众所周知,疫苗是预防疾病最有效的方法之一,然而,截止目前,国内外还没有禽衣原体商业化疫苗来预防禽衣原体病。而对哺乳动物有较好免疫效果的衣原体灭活疫苗却不能用于预防禽类的衣原体病,因而不得不放弃。
曾有文献披露禽源鹦鹉热衣原体DNA疫苗(核酸疫苗)(参见Dvanrompay,,,1999,11849-55)和禽源鹦鹉热衣原体亚单位疫苗(参见何诚,朱虹,王传武.“鹦鹉热衣原体重组主要外膜蛋白免疫***效果观察”《中国农业大学学报》2004,149-52)。但DNA疫苗注射到动物体内后容易降解。另外,因制备DNA疫苗时需具备大量的载体,因此其制备的成本高,并且不稳定。而亚单位疫苗在生产过程中需对MOMP蛋白需要大量的表达,然后提取表达蛋白,纯化浓缩后免疫动物,这一过程过程在实验室可以进行,但在实际生产中却难以应用,因为制备的成本太高。另外,亚单位疫苗类似于灭活疫苗,在刺激机体产生免疫时主要以体液免疫为主,而衣原体感染主要是细胞内的感染,细胞免疫应该发挥主要作用,腺病毒疫苗却具备了这方面的特点。
因此,研究适合于预防禽衣原体病的高效疫苗势在必行。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的禽源鹦鹉热衣原体疫苗的制备方法及用这种方法制备的疫苗。这种疫苗是禽源鹦鹉热衣原体活载体疫苗,它可以克服现有技术的一些不足,可有效提高禽类免疫功能,并且其制备的成本较现有技术低,且制备方法更为简单。
本发明的制备方法是,从患禽衣原体病的禽体内分离出鹦鹉热衣原体,通过PCR方法扩增到外膜主蛋白基因(MOMP),将其在pMD-simpleT载体中克隆,切下目的基因后将其插入到pshuttle-CMV载体中,再提取出质粒后将其线性化后转入BJ5183感受态细胞中进行同源重组获得重组腺病毒质粒,将重组腺病毒质粒转化至DH5α菌,提取出质粒转染AD-293细胞获得重组腺病毒,再加入保护剂进行冻干。
本发明的禽源鹦鹉热衣原体外膜主蛋白基因(MOMP)序列如下ATGAAAAAACTCTTGAAATCGGCATTATTGTTTGCCGCTACGGGTTCCGCTCTCTCCTTACAAGCCTTGCCTGTAGGGAACCCAGCTGAACCAAGTTTATTAATCGATGGCACTATGTGGGAAGGTGCTTCAGGTGATCCTTGCGATCCTTGCTCTACTTGGTGTGATGCTATCAGCATCCGCGCAGGATACTACGGAGATTATGTTTTCGATCGTGTATTAAAAGTTGATGTGAATAAAACTATCACCGGCATGGGTGCAGTTCCTACAGGAACCGCAGCAGCTAATTACAAAACTCCTACGGATAGACCCAACATCGCTTACGGCAAACACTTACAAGACGCCGAATGGTTCACCAATGCAGCTTTCCTCGCATTGAATATCTGGGATCGCTTTGATATTTTCTGCACATTAGGCGCTTCTAATGGGTACTTCAAAGCTAGTTCTGCGGCATTCAACCTCGTTGGTTTGATTGGTGTTAAAGGATCCTCCATAGCAGCTGATCAGCTTCCCAATGTAGGCATCACTCAAGGAATCGTTGAATTTTATACAGATACAACATTCTCTTGGAGTGTAGGTGCACGCGGAGCTTTATGGGAGTGTGGTTGTGCGACTTTAGGAGCAGAGTTCCAATACGCTCAGTCTAATCCTAAAATTGAAATGTTGAATGTAGTCTCCAGCCCAGCACAATTTGTGGTTCACAAGCCTAGAGGATACAA
GGGAACAGCATTTCCTTTACCTCTAACAGCTGGTACTGATCAGGCAACTGACACTAAGTCGGCTACAATTAAATACCACGAATGGCAAGTTGGTTTAGCGCTCTCTTATCGATTGAACATGCTTGTTCCTTACATTGGCGTAAACTGGTCACGAGCAACTTTTGATGCTGACGCTATCCGCATCGCTCAACCTAAATTAGCTGCTGCTGTGTTAAACTTGACCACATGGAACCCAACCCTTTTAGGAGAAGCTACAGCTTTAGATACTAGCAACAAATTCGCTGACTTCTTGCAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAGTCTAGAAAAGCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAACGTTAATCGACGCTGACAAATGGTCAATCACTGGTGAAGCACGCTTAATCAATGAAAGAGCCGCTCACATGAATGCTCAATTCAGATTCTAA。
在本发明的制备过程中,~,放入研钵中进行研磨,加1mlTE缓冲液,再加入20%SDS至终浓度为1%,混匀,再加入蛋白酶K至终浓度100~200ug/ml,混匀后放入60℃水浴30min。取出,转入37℃水浴中12~24h,期间不时振摇数次,再加入等体积的平衡酚,倒转混匀,4℃条件下7500rpm离心10min,吸取上层水相,加入等体积的酚∶***仿∶异戊醇=25∶24∶1的混合液,经混匀后,4℃条件下吸取上层水相,-20℃的无水乙醇,再进行离心沉淀,沉淀物在自然状态下干燥后用
TE或双蒸水进行溶解;本发明的制备过程中,在PCR反应管中加入10×PCR缓冲液5μL,dNTP4μL,再加入上下游引物各1μL、模板6μL、,组成50μL体系,反应条件是先95℃变性5min,然后94℃,49℃,72℃2min,共40个循环。
由以上方法制备出禽源鹦鹉热衣原体活载体疫苗。
本发明所制备的疫苗对禽类有明显的免疫效果,而且进入到动物体内后不发生降解,而且本发明可使细胞免疫发挥主要作用,因此其免疫效果将优于现的技术。另外,本发明制备疫苗时不需要大量的载体,其制备成本也要低于现有技术。
图1为重组质粒酶切鉴定、PCR鉴定图(MDL2000marker)。其中1、重组质粒酶切鉴定产物2、阴性对照;3、PCR鉴定产物图2为重组腺病毒目的基因PCR鉴定(MDL2000)。其中1、目的基因2、阴性对照具体实施方式
1)基因组DNA的提取a)~,放入研钵中进行研磨,加1mlTE(Tris-Cl和EDTA)缓冲液,。
b)加入20%SDS至终浓度为1%,混匀,再加入蛋白酶K至终浓度100~200ug/ml,混匀后放入60℃水浴30min,使衣原体的外膜被破坏,将衣原体的基因组释放出来。然后将体系取出,转入
37℃水浴中12~24h,在这一过程中不时振摇数次。
c)加入等体积的平衡酚,倒转混匀,4℃条件下7500rpm离心10min,吸取上层水相,重复抽提一次。取数次水相,加入等体积的***仿∶异戊醇(24∶1),倒转混匀,4℃条件下7500rpm离心10min,使衣原体的基因组与破坏的衣原体外膜相分离,以便稍后的提取出衣原体外膜。然后抽取上层水相,-20℃的无水乙醇,12000rpm离心处理10分钟后,分出沉淀物,在自然状态下干燥后用再TE或双蒸水进行溶解,置-20℃或4℃保存。
2)MOMP基因的扩增在200μLPCR反应管中加入10×PCR缓冲液5μL,dNTP4μL,取表1所示的上下游引物各1μL,模板6μL,,,组成50μL体系。反应条件如下在95℃进行变性处理5min,然后再在94℃,49℃,72℃放置2min,再重复进行94℃,以及后续程序,共进行35个循环,最后一次在72℃延伸10min。
表1
*上述数字区间表示对应引物在禽衣原体株外膜蛋白基因读码框中的位置。
3)MOMP基因回收利用商品化的DNA回收试剂盒回收MOMP。本发明中所用的试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司生产的回收试剂盒。
4)MOMP基因的克隆将PCR产物连接到pMD18-T载体,经转化、涂板,置37℃过夜培养,挑取菌落进行鉴定,送阳性菌液测序,根据测序结果,在原有引物上各设计一个酶切位点(上游引物添加限制性内切酶BgLII,下游引物添加限制性内切酶SaI),然后进行PCR扩增,将扩增产物连接到pMD18-Tsimple载体,转入JM109感受态细菌中,涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板,置37℃培养箱培养12-16h。然后挑取单个菌落进行酶切鉴定、PCR鉴定。
5)MOMP基因与pshuttle-CMV载体的连接用BgLII和SaLI对阳性pMD18-Tsimple进行双酶切,然后回收目的片段。用T4DNA-连接酶连接到已用BgLII和SaLI双酶切、纯化、回收的pshuttle-CMV载体中,转入DH5α感受态细胞中,涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板,置37℃培养箱过夜培养,挑取单个菌落,进行增菌培养,提取质粒(商品化的质粒提取试剂盒),然后进行酶切鉴定和PCR鉴定。
酶切鉴定过程在200μL的反应管中加入4μL的双蒸水,4μL提取的质粒,1μL10倍浓缩的H缓冲液(商品化),(商品化)(商品化),37℃水浴中酶切4h。
PCR鉴定在200μLPCR反应管中加入10×PCR缓冲液5μL,dNTP4μL,上下游引物各1μL,模板6μL,
,,组成50μL体系。反应条件如下94℃,49℃,72℃2min,共35个循环,最后72℃延伸10min。
结果参见附图1,通过酶切鉴定和PCR鉴定,说明目的基因正确插入到pMD18-T载体中。
6)细菌内同源重组构建重组腺病毒质粒将经酶切鉴定和PCR鉴定的阳性pshuttle-CMV质粒10μL,在2500V,200Ω,25μF的条件下,电穿孔共转化80μLBJ5183感受态细胞,用含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板筛选,37℃培养箱培养16-20h后挑取8个克隆,提取质粒进行电泳鉴定,将重组子转化至DH5α菌,提取质粒,进一步进行酶切鉴定。
7)重组腺病毒质粒在293细胞中进行包装提取重组腺病毒质粒大约30ug,,轻轻混匀。,混匀,室温放置5min。将稀释好的重组腺病毒加入到稀释好的脂质体中,室温放置20min。取2ml脂质体-DNA混合物加入到在24小时内长到95%的293细胞中,轻轻摇动细胞瓶。将细胞瓶置于37℃含有5%CO2培养箱中6小时,然后加入6ml含有胎牛血清的DMEM培养基,培养3-7天。
8)目的基因的PCR鉴定取经过3代以后病变的293细胞,反复冻溶3次,取1ml冻融液,加入10%SDS50μl和3μl的蛋白酶K,60℃作用30min,然后置37℃水浴作用2h,加入等体积的平衡酚,倒转混匀,
4℃条件下7500rpm离心10min,吸取上层水相,重复抽提一次。取上层水相,加入等体积的***仿∶异戊醇(24∶1),倒转混匀,4℃条件下7500rpm离心10min。取上层水相,,12000rpm离心10min。沉淀在自然状态下干燥后用TE或双蒸水进行溶解,置一20℃或4℃保存。用CHL-M15′-ATGAAAAAACTCTTGAAATCG-3,CHL-M25′-TTAGAATCTGAATTGAGCATTC-3引物进行扩增MOMP,扩增条件94℃预变性5min,94℃变性30s,49℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环,最后72℃延伸10min。检测是否由含由MOMP目的基因的重组腺病毒引起的病变。
检测结果参见附图2。通过PCR鉴定图,说明目的基因正确插入到腺病毒载体中。
9)重组腺病毒目的基因表达产物的鉴定运用间接免疫荧光进行检测将灭菌的载玻片置于6孔细胞培养板,接入293细胞,待细胞长满90%的面积时接入重组腺病毒,培养至90%细胞病变,取出载玻片,用甲醇进行固定(-20℃,20min),同时做阴性对照。固定好的载玻片加入衣原体阳性血清,37℃作用2小时,用PBS液漂洗3次,每次5min,加入用荧光素标记的二抗,37℃孵育30分钟,然后用PBS液漂洗3次,每次5min,待自然干燥后置荧光显微镜下进行观察。
10)重组腺病毒滴度测定重组腺病毒经过数代传代,待病毒感染细胞时间稳定后进行毒价的测定。取病变的
293细胞,反复冻融3次,在1ml体积的培养液中进行10倍系列稀释,将稀释的10-5-10-9病毒粒子分别加入已长满90%293细胞的6孔板细胞培养板,最后一孔留阴性对照。37℃培养2h,%琼脂糖的DMEM营养液,在5%CO2的37℃细胞培养箱进行培养,每日观察,培养6-7天。
11)实验动物免疫购买SPF小鸡40只,抽样采血检测衣原体抗体和产蛋下降综合症抗体,然后进行重组腺病毒免疫,肌肉免疫10只,皮下免疫10只,。%的生理盐水。免疫前对所购买的SPF鸡进行衣原体抗体检测和产蛋下降综合症,结果全部为阴性。免疫后第8日进行禽衣原体MOMP抗体的检测,肌肉免疫的抗体水平达1∶16,个别鸡的抗体水平甚至超过了1∶64。而皮下免疫鸡的抗体水平达1∶16,并且抗体水平比较整齐,T淋巴细胞检测结果显示重组腺病***激机体产生了细胞免疫。
该疫苗的免疫机理与衣原体侵入动物机体机理一致,具备了亚单位疫苗所不能具备的效果。同时,该苗制备成本低,免疫剂量少,免疫效果好,且稳定、不降解。
权利要求
,其特征在于从患禽衣原体病的禽体内分离出鹦鹉热衣原体,通过PCR方法扩增到外膜主蛋白基因(MOMP),将其在pMD-simpleT载体中克隆,切下目的基因后将其插入到