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羟脯氨酸
修贺明郭争荣徐铮
【abstract】 objective:
目前,人们对传统的HYP含量的测定方法-盐酸水解法已达成了共识,但是传统方法对组织要求量比较大,水解不够彻底等缺点限制了其广泛应用。近年来大批的学者对HYP的测定条件进行了多方面、多层次、多途径的研究,同时也深入的探讨了不同测定方法,虽然在时间、试剂用量、所需器材等方面有了很大的改进,但对其测定方法的研究欠少,仍未能找到一种方便、快捷、可靠性高的测定方法。笔者对HYP含量测定方法进行了仔细的研究,针对传统方法的缺点对传统方法进行了改进,在组织、重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛(PDAB)一定的条件下,对两种方法进行了比较,探索出一条更为先进、更为稳定可靠的HYP检测方法。现报道如下:
一,材料及其方法
1,主要实验材料
酶标仪美国VERSAmax
微量电子天平瑞士METTLer AE260
对二氨基苯甲醛天津市博迪化工有限公司
******-T 天津市精细化工研究所
2,试剂配制
标准HYP储存液(1mg/ml):称取100mgHYP标准品,用
,
置棕色瓶于4℃保存。
标准HYP应用液(25ug/ml):取标准HYP储存液(1mg/ml),双蒸水定容至100ml, 4℃保存,可用2-3周。
柠檬酸缓冲液(PH=):。
******-T溶液:******-T用少量甲醇溶解并定容至100ml。
10%对二氨基苯甲醛(PDAB):10gPDAB用少量甲醇溶解并定容至100ml。
***酸溶液:70%高***酸27ml加蒸水至100ml。
40%NaOH溶液:40gNaOH双蒸水溶解并定容至100ml。
%胃蛋白酶溶液:。 3,组织样品
本实验组织样品为肝硬化大鼠肝组织(Wistar大鼠由河北医科大学动物实验中心提供),%硫代乙酰***(TAA)喂饲5月制备[1],经病理检查证实为肝硬化后用25%硫奔妥钠腹腔麻醉后开腹摘取肝右叶,-80℃保存备用。
4,标准曲线的制备
(2)()******-T溶液,37℃水裕氧化25分钟。
(3)***酸溶液1ml,混匀,室温作用5分钟终止氧化。
(4)10%的对二甲氨基苯甲醛溶液1ml,混匀,100℃沸水3分钟(显色)。
(5)冰裕冷却,空白凋零,酶标仪测定A560nm
(1)微量天平称取肝组织50mg,匀浆器匀浆。
(2)加入3ml 6mol/l盐酸,混匀,移入15ml的试管,120℃高压水解2小时。
(3)40%,然后12000转离心15分钟。
(4)取500ul上清加入一新准备的15ml试管中,()******-T