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农杆菌介导转化法的概述
自从1983年转基因植物诞生以来,植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因,通过各种方法转移到植物的基因组中,使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状,如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1]
目前,应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性,容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点,而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定,是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化法在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。
1 关于农杆菌
农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。
根癌农杆菌
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤;Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质,为双链共价闭合环状DNA分子,大小约200-250kb。
依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同,根癌农杆菌可分为4种类型:章鱼碱型(Octopine)、胭脂碱型(Nopaline)、农杆碱型(Agropine)和琥珀碱型(inamopine)。
原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区:
-DNA区(Transfer—DNA region):不同来源的菌株,T-DNA的长度在12~24 kb,它是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T--DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25
14 bp是完全保守的,分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)(LB和RB)是T—DNA转移所必需的,只要其存在,T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中,转移的方向是从右向左,T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用,因此,尤以右边界更为重要。
(vir区):位于T-DNA以外的1个30-40kb的区域内,该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中,但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。目前,对章鱼碱型农杆菌Ti质粒pTi15955和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进行了全序列分析,在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子,分别为virA-vjrH,共包括23个基因(virA,virB1-virB11,virC1,virC2,virD1-virD4,virE1,virE2,virF,virG,virH).而胭脂碱型Ti质粒的vir区不含vjrF和virH操纵子,它含有另一个基因tzs ,也有学者认为有大约35个vir基因成簇排布于vir区。