基因敲除新技术.ppt

ZFN 技术原理
锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)是人工改造的限制性核酸内切酶,利用不同的锌指结构识别特异DNA序列,利用核酸酶切断靶DNA。
锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基;
人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列,通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基,TGEK是多个螺旋间的连接序列;
构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白(ZFN)可以在指定区域切断DNA双链。
ZFN 技术
锌指核酸酶介导的定向染色体删除
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑,比如基因敲除。已建立有ZFN库,识别多种DNA序列,但还不能达到识别任意靶DNA的目的,其应用受到一定的限制。
崭新的技术- TALEN
经典的挑战–染色体DNA序列的人工编辑修改
(点)突变:Silent;Missense; Nonsense;Frame shift (基因敲除,Knockout)
片段删除
片段插入
目的与用途:生物模型;表达工具;基因治疗
崭新的技术解决经典的挑战
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具,现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。
技术原理:
表达一个重组核酸酶,在靶点识别结构域的作用下,核酸酶识别靶点核酸序列,并发挥内切酶活性,从而打断目标基因,完成基因敲除的过程。
1989年植物病原体黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)
avrBs3 基因被克隆。
2007年发现其序列特异性核酸结合特性, avrBs3 – TA
2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译
由34个aa组成一个单元模块,重复17 -18次
34个aa中的第12和13个氨基酸(Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基
TALEN 发展过程
人工构建TALE模块识别指定核酸序列
102碱基模块单元
…… 14 – 18个重复
真核表达
…… 14 – 18个重复
特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
34氨基酸单元
TALEN 发展过程