基因敲除新技术.ppt

基因敲除新技术ZFN技术原理锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases,ZFN)是人工改造的限制性核酸内切酶,利用不同的锌指结构识别特异DNA序列,利用核酸酶切断靶DNA。锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基;人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列,通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基,TGEK是多个螺旋间的连接序列;构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白(ZFN)可以在指定区域切断DNA双链。ZFN技术锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑,比如基因敲除。已建立有ZFN库,识别多种DNA序列,但还不能达到识别任意靶DNA的目的,其应用受到一定的限制。崭新的技术-TALEN经典的挑战–染色体DNA序列的人工编辑修改(点)突变:Silent;Missense;Nonsense;Frameshift(基因敲除,Knockout)片段删除片段插入目的与用途:生物模型;表达工具;基因治疗崭新的技术解决经典的挑战靶向基因技术经典方法:***质粒,同源重组–几率低(~1HReventper106cells),难!饱含希望与失望的技术:ZFN,被Sigma公司垄断新的里程碑:TALENTALEN技术基于TALEN(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具,现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。技术原理:表达一个重组核酸酶,在靶点识别结构域的作用下,核酸酶识别靶点核酸序列,并发挥内切酶活性,从而打断目标基因,完成基因敲除的过程。1989年植物病原体黄单胞菌属(Xanthomonasspp.)avrBs3基因被克隆。2007年发现其序列特异性核酸结合特性,avrBs3–TA2009年XanthomonasTA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译由34个aa组成一个单元模块,重复17-18次34个aa中的第12和13个氨基酸(RepeatVariantDi-residue,RVD)对应识别一个目标碱基TALEN发展过程人工构建TALE模块识别指定核酸序列102碱基模块单元……14–18个重复真核表达……14–18个重复特异识别指定的14-18个核酸序列并与之结合34氨基酸单元TALEN发展过程