生化实验 转氨酶(GPT)活性的测定报告.doc

生化实验_转氨酶(GPT)活性的测定报告实验二(2) 转氨酶(GPT)活性的测定
研究背景及目的
转氨酶是生物体内重要的一类酶。转氨酶催化α-氨基酸的氨基与α-***酸的***基之间的相互转化而生成一种新的氨基酸与一种的新的***酸,这种作用被称为转氨基作用[1]。转氨酶种类很多,体内除了赖氨酸、苏氨酸外,其余α-氨基酸都可参加转氨基作用并各有其特异的转氨酶。其中以谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)最为重要。GPT与GOT活性的测定在临床上有着重要应用,可作为一些疾病诊断的指标。GPT催化的是谷氨酸与***酸之间的转氨作用,GOT催化的是谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用,草酰乙酸在柠檬酸苯***溶液中可以转变为***酸与二氧化碳。由于都有***酸的生成,所以可以通过实验测定一定时间内***酸的生成量而计算这两种转氨酶的活性。本实验以动物的新鲜肝脏和血清为材料,分别测定其中的GTP的活性,以此来研究该转氨酶活性的测定方法。
原理
由于动物肝脏和血清中的转氨酶活性较高,易于测得,且动物或人的转氨酶活性的测定应用广泛、技术成熟,因此本试验选取家兔的新鲜肝脏和血清为实验材料,对其中的一种重要转氨酶——GTP的活性进行测定。转氨酶活性测定的历史沿革建立了金氏法、穆氏法及赖氏法等较成熟的基本方法,本实验采用的是金氏法。该方法对转氨酶活力的定义是:血清在37℃,,与底物作用60min后,每生成1μM***酸为一个转氨酶活性单位。***酸含量的测定运用的是比色法。***酸可与2,4-二硝基苯肼反应,生成***酸二硝基苯腙,在碱性溶液中显棕红色,所以通过测定溶液在520nm下的光吸收值并与标准溶液比色便可计算出***酸的含量,***酸的含量对应于一定的转氨酶活力单位。

材料、试剂与仪器
材料:
新鲜家兔肝脏和血清
试剂[1]:
①磷酸盐缓冲液()
甲液:1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液
乙液:1/15 mol/L磷酸氢二钾溶液
取甲液825ml,乙液175ml,混合,。
② GTP基质液
称取α-***-,,再加缓冲液70ml,并移入100ml容量瓶中,加1mol/,,。贮存于冰箱中备用,可保存一周时间。
③ 2,4-硝基苯肼溶液
称取2,4二硝基苯肼20mg,先溶于10ml浓盐酸中,再以蒸馏水稀释至100ml,棕色试剂瓶内保存。
④***酸标准液
精确称取***酸钠22mg。溶解后转入100ml容量瓶中,。
⑤柠檬酸苯***溶液
取柠檬酸50g溶于50ml蒸馏水中,再加苯***充分混合即可,低温出现结晶时,可置于37℃水浴中溶解后应用。
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仪器:
DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司,编号L304056)
TPL-4OB低温台式离心机(上海安亭科学仪器厂,编号20070529)
722光栅分光光度计(上海紧密科学仪器有限公司)
大龙系列加样器及吸头(20-200μl,100-1000μl,1000-5000μ)
JP-100架盘药物天平(美国双杰兄弟有限公司,编号3878)
配平天平(北京医用天平厂)
刻度试管,离心