毕业设计（论文）小鼠microRNA-125b过表达载体构建.doc

本科毕业设计
小鼠microRNA-125b过表达载体构建
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指导教师
20xx 年 xx月xx日

前言
microRNA(miRNA,微小RNA)是一类长约20-24个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,进化上具有高度保守性,广泛存在于真核生物中。成熟miRNA能够与靶基因3′UTR以完全互补或不完全互补的形式结合,诱导靶mRNA降解或抑制蛋白翻译,导致相应蛋白质合成缺失或减少,从而在转录水平、转录后水平、表观遗传水平等调控基因表达,参与生命过程中一系列的重要进程[1]。到目前为止,在人类和小鼠中分别发现超过1000和750种miRNA,其中一些主要在大脑中表达[2-4],人类有接近1/3的基因受到miRNA的调控[5]。近年来的大量研究表明,miRNA的异常表达广泛参与了肿瘤、心血管疾病和糖尿病等重大疾病的发生与发展。同时,miRNA也参与了神经系统生长发育和生理功能的调控,其表达异常与神经退行性疾病的发生发展相关[6]。
C1型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease type C1, NPC1)是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病,迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释[7,8]。研究表明,tau蛋白和Aβ(Amyloid beta,β-淀粉样蛋白)在神经退行性病变中紧密联系,存在协同作用。tau蛋白在调节轴突运输功能的同时,亦参与Aβ的致病机制,加剧Aβ导致的神经元毒性、微管丢失、神经炎症变化等,进而导致神经变性和学****记忆障碍,揭示tau蛋白在神经元细胞变性的发生发展中起重要作用[9,10]。目前,虽然对tau蛋白参与神经退行性疾病的具体机理尚不明确,但已证实,抑制神经元tau蛋白过度磷酸化可以有效缓解神经退行性病变的发生和发展[11]。
miRNA对tau蛋白磷酸化的调控和神经元存活至关重要,通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的表达来调控tau蛋白磷酸化水平。miR-125b在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)中的发病机理是促进tau蛋白过度磷酸化。miR-125b超表达会引起tau蛋白过度磷酸化,分别上调蛋白激酶p35、cdk5和p44/42-MAPK和下调蛋白磷酸酯酶DUSP6、PPP1CA及抗凋亡因子Bcl-W的表达。抑制蛋白磷酸酯酶的表达会导致tau蛋白过度磷酸化,超表达PPP1CA和Bcl-W会阻止miR-125b引起的过度磷酸化,证实蛋白磷酸酯酶可以调节miR-125b对tau蛋白的影响。然而,抑制神经元中miR-125b的表达会降低tau蛋白过度磷酸化和蛋白激酶活性。另外,在小鼠海马内注射miR-125b会损害联想学****以及下调DUSP6、PPP1CA和Bcl-W表达,并增强tau蛋白过度磷酸化
[12]。
本研究构建了小鼠miR-125b的真核过表达载体,为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。
二、材料与方法
材料
BALB/c小鼠、大肠杆菌DH5α感受态细胞、-EGFP质粒均由实验室保存。


PurePlasmid Mini Kit、2×Es Taq MsterMix(康为世纪)、DNA Fragment Purification kit(TaKaRa)、10×quick cut Buffer、10×quick cut Green Buffer、QuickCutTM Nhe I、QuickCutTM EcoR I、ddH2O、10×T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase Buffer、LB液体培养基、LB固体培养基、DNA Marker 2000bp、水合***醛、琼脂糖、EB。

本研究所用主要仪器的名称和生产厂家见表1。
表1 主要实验仪器
仪器
生产厂家
96孔梯度PCR仪
ABI公司
水浴锅
北京光明医疗仪器有限公司
高压灭菌锅
上海申安医疗器械场
恒温摇菌摇床
江苏海门其林医用仪器厂
台式高速冷冻离心机
SIGMA
Nanodrop 2000分光光度计
Thermo
单人双面净化作台
苏州净化设备有限公司
电子天平
上海精天电子
电泳仪
北京市六一仪器厂
凝胶成像系统
Uvitec公司
10µl微量移液枪
Eppendorf
100µl微量移液枪
Eppendorf
1000µl微量移液枪
Eppendorf
电热恒温培养箱
北京中兴伟业仪器有限公司
气浴恒温振荡器
上海比朗仪器有限公司
低温恒温槽
上海平轩科学仪器有限公