小鼠microRNA-125b过表达载体构建 毕业论文.doc

小鼠microRNA-125b过表达载体构建
目录
摘要 1
Abstract 3
1 前言 4
2 材料与方法 5
材料 5
5
5
5
方法 6
6
6
PCR引物设计与合成 7
PCR扩增 7
7
DNA产物纯化及回收 8
8
9
3 结果与分析 9
4 讨论 11
5 结论 11
6 参考文献 12
致谢 14
摘要
NPC1是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病,迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释。研究发现miRNA对tau蛋白的调控和神经元存活至关重要,通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶来调节tau蛋白磷酸化水平。Tau 蛋白过度磷酸化损伤神经细胞功能和结构,如过度磷酸化使Tau 蛋白结合微管能力降低[1],Tau 蛋白在神经元内聚积导致神经元轴突转运障碍[2]、乙酰胆碱释放减少[3]、蛋白酶体活性抑制[4-7],这些功能和结构的改变可能导致神经元呈慢性进行性变性构建miR-125b表达载体,从tau蛋白磷酸化调控的研究入手,系统地研究参与tau蛋白磷酸化调控的miR-125b的靶基因,阐释其中的分子作用机制,为tau蛋白异常病变引起的神经退行性疾病的研究与防治提供新的思路。
本实验目的:构建小鼠microRNA-125b(miR-125b)过表达载体。
方法:参考小鼠miR-125b前体序列的PCR扩增引物,重新设计限制性内切酶位点为Nhe I和EcoR I,PCR扩增,-EGFP质粒进行双酶切鉴定,使用T4 DNA连接酶进行连接,转化DH5α感受态细胞,挑取重组阳性克隆,对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。
结果:菌液PCR筛选鉴定出正确的miR-125b过表达载体,测序分析证实克隆的基因序列正确。
结论:成功构建小鼠miR-125b的真核表达载体,为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。
关键词:microRNA-125b;-EGFP;过表达载体
Construction of microRNA-125b overexpression vector in mouse
Abstract
Objective To construct the microRNA-125b(miR-125b) overexpression vector in mouse. Methods PCR amplification primers of miR-125b precursor sequence referred to article, we redesigned restriction enzymes for Nhe I and EcoR I. After being confirmed by PCR amplification, the target fragment and -EGFP plasmid were identified by double digestion., and connected using T4 DNA ligase. Then, it was transformed in petent cells. Finally, the binant plasmid were picked, and identified by double digestion, agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results miR-125b precursor sequence was essfully inserted into -EGFP plasmid by identification of DNA sequencing. Conclusion The eukaryotic expression vector of mouse miR-125b has been essfully constructed, which provides a foundation for further studying the mechanism of tau phosphorylation regulated by miR-125b in Niemann-Pick type C1 diseas