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4、双链DNA复制的分子机制
(以大肠杆菌为例)
双链的解开
RNA引物的合成
DNA链的延伸
切除RNA引物,填补缺口,连接相邻的DN***段
(1)双链的解开
一些概念:
DNA的复制有特定的起始位点,叫做复制原点。常用ori(或o)表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。
大肠杆菌染色体DNA以及真核生物的细胞器DNA为双链环状,只有一个复制原点,而真核生物染色体DNA是线性双链分子,含有许多复制起点。
从复制原点到终点,组成一个复制单位,叫复制子(基因组独立进行复制的单位)。
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复制原点由DnaA蛋白识别, 在原点由DnaB蛋白(解螺旋酶)将双螺旋解开成单链状态,分别作为模板,合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π、 SSB),在原点处形成一个眼状结构,叫复制眼。
DNA复制进行时,在眼的两侧出现两个叉子状的生长点(growth point),叫复制叉。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子,它们构成的复合物称为复制体(replisome)
复制叉
复制叉
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复制叉
起点
复制叉
延伸
延伸
起点
领头链
领头链
随后链
随后链
3’
5’
3’
5’
DNA的双向复制
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(2)RNA引物的合成
引发体在复制叉上移动,沿模板链5’ 3’的方向移动,与复制叉移动的方向相同,识别合成的起始位点, DnaB蛋白活化引物合成酶。引发RNA引物的合成。领头链先引发开始合成,以原来一条DNA单链为模板(3’ 5’),按5’ 3’的方向合成一段RNA引物链。领头链开始合成后,随后链也开始合成其引物。引物长度约为几个至10个核苷酸,在引物的5’端含3个磷酸残基(引物酶的底物是核苷三磷酸),3’端为游离的羟基。
RNA引物的合成称为“引发”。引发是一个十分复杂的过程,已经证明大肠杆菌、枯草杆菌和淋巴细胞等DNA的复制的引发需要一种称为“引物体”(primosome)的RNA合成系统。引物体是由引物合成酶和另外的几种蛋白质共同组成的。它可以沿模板链向分叉的方向前进,并断断续续地引发生成后随链的引物RNA短链。引物RNA一般只含少数核苷酸残基(原核生物约为100个核苷酸,真核生物约为10个核苷酸左右)。
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(3)DNA链的延伸
在DNA聚合酶Ш的催化下,以四种脱氧核糖核苷5’-三磷酸为底物,在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。两条链方向相反。
领头链
随后链
冈崎片段
半不连续复制
冈崎模型
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在DNA聚合酶Ⅲ的作用下,在引物的3’-端逐个添加与模板碱基顺序互补的脱氧核苷酸单位以完成冈崎片段或完整链的合成。然后通过DNA聚合酶Ⅰ的5’至3’的外切酶活性将RNA引物上的核苷酸单位逐个除去。每个核苷酸单位被切除后立即被与模板链相应位置碱基互补的脱氧核苷酸补上。这后一反应是利用前面的冈崎片段作为引物通过DNA聚合酶Ⅰ的聚合酶活性完成的。
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领头链—在DNA复制时,合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。
随后链—在DNA复制时,合成方向与复制叉移动的方向相反,形成许多不连续的片段,最后再连成一条完整的DNA链。
半不连续复制—在DNA复制时,领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的,这种复制方式称为半不连续复制。
发现(1968):
同位素实验,3HdT短时间内为DNA小片段一段时间后检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时,检测到大量DN***段的积累。——证明DNA复制中有小片段合成。
测定DNA小片段,远远大于合成DNA的一半。由于U替代dT,被尿嘧啶-N-糖基酶切除。
在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中,检测到一半3H标记出现在小片段(冈崎片段)中。
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冈崎片段
在DNA复制过程中,领头链能连续合成,而随后链只能是断续的合成53 的多个短片段,这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。
冈崎片段:真核生物中100-200个核苷酸(核小体的DNA单位)。原核生物中1000-2000个核苷酸(相当于一个顺反子)。
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1968年冈崎等用3H脱氧胸苷掺入噬菌体感染的大肠杆菌,然后分离标记的DNA产物,发现短时间内首先合成的是较短是DN***段,接着出现较大的分子。一般把这些DN***段称为冈崎片段。进一步研究证明,冈崎片段在细菌和真核生物中普遍存在。细菌的冈崎片段较长,约有1000-2000个核苷酸;真核生物的较短,约为100-200个核苷酸。
冈崎等最初做的实验不能判断DNA链的不连续合成只发生在一条链上,还是两条链都如此。后来进行了大量的实验证明,在DNA进行复制时,一条链是连续