血清谷—丙转氨酶活性的测定（改良赖氏法）.ppt

实验
血清谷—丙转氨酶活性的测定
浙江中医药大学生命科学学院
生物化学教研室
【目的要求】
,掌握酶活性单位含义。

【实验原理】
:血清中的谷-丙转氨酶(ALT),在37℃、,可催化基质(底物)液中的丙氨酸与α-***戊二酸生成谷氨酸和***酸:
生成的***酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应,生成***酸-2,4-二硝基苯腙,进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物,其颜色的深浅在一定范围内与***酸的生成量,亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的***酸标准液相比较,便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。
尽管基质液中余下的a-***戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果,但因其量不多,加之对505nm的吸光度远不如***酸生成的苯腙硝醌化合物强,尤其用标准曲线作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正,摈弃了赖氏法一些固有弊端,结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理,全国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。

***酸+ NADH+H + ———————L-乳酸+NAD+
NADH在340nm处上有特征吸收峰:过测定吸光度的下降来反映ALT的活性
什么是改良赖氏法?
卡门法:
丙氨酸+α-***戊二酸***酸+谷氨酸
乳酸脱氢酶
***酸+ NADH+H + NAD++乳酸
在紫外分光光度法中,NADH在340nm波长处的吸光度降低值与ALT活性成正比。
卡门氏酶单位:1ml血清(反应溶液总量为3ml)在340nm波长下,,在25摄氏度,1分钟内生成的***酸,在乳酸脱氢酶催化下,使NADH+ + H+变成NAD+,。
什么是改良赖氏法?
赖氏法
改变了***酸含量的测定方法
***酸+2,4-二硝基苯肼***酸+ 2,4 -二硝基苯腙+H2O
改良赖氏法
赖氏法的测定方法+卡门氏法的酶单位定义
赖氏法考虑到底物浓度不足,酶作用产生的***酸的量不能与酶活性成正比,故没有制定自身的单位定义,而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位。赖氏法校正曲线所定的单位是用比色法的实验结果和卡门分光光度法实验结果作对比后求得的,以卡门氏单位报告结果。卡门法是早期的酶偶联速率测定法,卡门氏单位是分光光度单位。定义为血清1ml,反应液总体积3ml,反应温度25℃,波长340nm,,()。赖氏法的测定温度原为40℃,校正曲线只到97个卡门氏单位,后来改用37℃测定将校正曲线延长至150卡门氏单位。赖氏比色法测定由于受底物α-***戊二酸浓度和2,4-二硝基苯肼浓度的不足以及反应产物***酸的反馈抑制等因素影响,校正曲线不能延长至200卡门氏单位。当血清标本酶活力超过150卡门氏单位时, NaCl溶液稀释后重测,其结果乘以稀释倍数。
:
R1:***盐缓冲液 100mol/L PH= L-丙氨酸 100mmol/L, α-***戊二酸 2mmol/L
R2:2,4-硝基苯肼 1mmol/L ,盐酸1mol/L
R3:氢氧化钠4 mol/L(用时稀释10倍)
标准***酸:2mol/L 2mL