血清谷丙转氨酶活性的测定(改良赖氏法).ppt

血清谷血清谷——丙转氨酶活性的丙转氨酶活性的测定(改良赖氏法)测定(改良赖氏法)??【【目的要求目的要求】】??。掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。??。方法。??。了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。??【【实验原理实验原理】】??血清中的谷血清中的谷--丙转氨酶(丙转氨酶(ALTALT),在),在3737℃℃、、,可催化基质(底物)液中的条件下,可催化基质(底物)液中的丙氨酸与的丙氨酸与αα--***戊二酸生成谷氨酸和******戊二酸生成谷氨酸和***酸:酸:生成的***酸可与起终止和显色作用的生成的***酸可与起终止和显色作用的2,42,4二硝基苯肼发生加二硝基苯肼发生加成反应,生成***酸成反应,生成***酸-2,4--2,4-二硝基苯腙,进而在碱性环境中二硝基苯腙,进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物,其颜色的深浅在一定范围生成红棕色的苯腙硝醌化合物,其颜色的深浅在一定范围内与***酸的生成量,亦即与内与***酸的生成量,亦即与ALTALT活性的高低成正比关系。活性的高低成正比关系。据此与同样处理的***酸标准液相比较,便可算出或通过据此与同样处理的***酸标准液相比较,便可算出或通过标准曲线查出血清中标准曲线查出血清中ALTALT的活性。的活性。尽管基质液中余下的尽管基质液中余下的a-a-***戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝***戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果,但因其量不多,加之对醌化合物而影响测定结果,但因其量不多,加之对505nm505nm的吸光度远不如***酸生成的苯腙硝醌化合物强,尤其用的吸光度远不如***酸生成的苯腙硝醌化合物强,尤其用标准曲线作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏分光光标准曲线作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正,摈弃了赖氏法一些固有弊端,结果比其他度速率法矫正,摈弃了赖氏法一些固有弊端,结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。监测法的单位使用赖氏法。19811981年全国常规生化检验方法年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定学术讨论会认为赖氏法测定ALTALT活性较为合理,全国肝炎活性较为合理,全国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。协作会议也建议统一使用改良赖氏法。??取干净试管取干净试管1212支,按下表所示标号,要求各支,按下表所示标号,要求各SS管和管和UU管进行双管平行操管进行双管平行操作。先做对照管和测定管,在作。先做对照管和测定管,在30min30min保温期间再做空白管和标准管。保温期间再做空白管和标准管。??【【实验结果实验结果】】??((即计量反应曲线即计量反应曲线) ) 在在坐标纸上以上表中坐标纸上以上表中AnAn--A 0A 0之值为纵坐标,相应的之值为纵坐标,相应的酶活性的卡门氏单位为横坐标作图,即得赖氏法酶活性的卡门氏单位为横坐标作图,即得赖氏法测定测定ALTALT的标准曲线的标准曲线????⑴⑴查标准曲线查标准曲线利用测定所得的吸光度结果利用测定所得的吸光度结果(AU(AU--AB)AB),便可从标准曲线上查得标本的,便可从标准曲线上查得标本的ALTALT结果结果??⑵⑵计算计算将实验测得的将实验测得的AUAU--AB AB 、、AS AS 代入下面计代入下面计算公式,即可算得标本中算公式,即可算得标本中ALTALT活性活性????【【方法评价方法评价】】??ALTALT活性测定主要有两类。一是卡门氏(活性测定主要有两类。一是卡门氏(KarmanKarman))分光光度法,测定的是酶促反应速率。其原理如分光光度法,测定的是酶促反应速率。其原理如下:下:??由于由于NADHNADH在波长在波长340nm340nm处有特异吸收峰,因此处有特异吸收峰,因此ALTALT的活性可通过的活性可通过NADHNADH的减少量,亦即通过的减少量,亦即通过340nm340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶酶ALTALT的底物外,还需要加入指示酶的底物外,还需要加入指示酶LDHLDH及其辅及其辅酶酶NADHNADH,又需用紫外分光光度计,因此不易为,又需用紫外分光光度计,因此不易为一般临床化验室推广。一般临床化验室推广。二是比色测定法,