实验五：考马斯亮蓝测定蛋白质含量.ppt

实验三:考马斯亮蓝测定蛋白质含量
:掌握考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的原理和操作.




六实验报告
:
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

721分光光度计;10 mL量筒1个;研钵;烧杯;量瓶;移液管:1 mL 3支,01 mL 3支;10 mL具塞刻度试管14支。

标准蛋白质溶液:用牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg/ mL的标准蛋白溶液;
考马斯亮蓝G-250溶液:称取100μg考马斯亮蓝G-250,溶于50 mL 90%乙醇中,加入85%的磷酸100 mL ,最后用蒸馏水定容到1000 mL ,贮放在棕色瓶中,此溶液在常温下可放置1个月。

(蛋白质含量为0~100μg/ mL)的绘制
牛血清蛋白溶液:浓度为100 μ g/ mL,按照表格配制

混合数次,放置5Min后,用1CM光径比色杯在595nM下比色(用第1管调0)。以蛋白质浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
管号
1
2
3
4
5
6
样品1
样品2
蛋白质标准液(ml)
0





1
1
蒸