重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活.doc

重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活.doc重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活
【摘要】目的: 利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素β4(Tβ4)并对其进行纯化和鉴定. 方法: 使用大肠杆菌偏爱密码子合***Tβ4全长基因,构建了Tβ4的二串联体基因(Tβ4②),将其克隆入表达载体pET22b(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达后,经盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白,采用免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对重组蛋白进行鉴定. 结果: 获得了纯化的重组Tβ4②蛋白,并具有生物学活性. 结论: 成功构建、表达和纯化了Tβ4②,为其功能研究奠定基础.
【关键词】胸腺素β4 串联重复序列克隆分子基因表达
0引言
胸腺素β4(thymosin beta 4, Tβ4)广泛分布于各组织、器官和细胞中,与免疫功能、神经发育和肌动蛋白功能密切,还可抗炎,促进血管生成[1]、创伤愈合[2]、毛囊发育[3],修复受损的心肌[4]. 虽然Tβ4有着广泛的应用前景,但由于其分子太小,难于直接在大肠杆菌中表达. 目前用于实验室及临床试验的Tβ4主要为化学合成品,价格昂贵,使其应用受到限制. 我们利用基因合成与PCR技术,构建了Tβ4的二串联体基因(Tβ4②)表达载体,在大肠杆菌中成功地表达和纯化了该串联体,为进一步的研究奠定了基础.
1材料和方法
22b(+),大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)由本中心保存;人Tβ4全长基因、测序(北京奥科生物技术有限责任公司);引物(上海英峻生物公司);限制性内切酶NdeⅠ, BamHⅠ, SalⅠ,T4 DNA连接酶以及DNA Marker DL2000(TaKaRa);Taq PCR Mix(天根生化科技有限公司);B型质粒小量提取试剂盒,小分子量DN***段高效快速回收试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司);蛋白分子质量标准(Fermentas);兔抗人Tβ4多克隆抗体(Abcam,ab14334);HRP山羊抗兔IgG,DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司);IPTG,琼脂,琼脂糖,MTT(北京鼎国生物技术有限责任公司); Phenyl Sepharose 6 Fast Floacia);ConA(华美生物工程公司),小鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司), RPMI1640(Gibco), Tβ4化学合成品(ProSpecTany),其他试剂均为国产分析纯;BALB/c小鼠,雄性,6~8周龄(第四军医大学实验动物中心).

②基因的克隆按照大肠杆菌惯用密码子及人胸腺素β4氨基酸序列设计并合成了编码Tβ4的全基因片段,5′和3′末端分别带有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点,将其克隆入pET22b(+)中, NdeⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后,将其命名为pET22b(+)Tβ4①;合成两条引物,上游引入BamHⅠ酶切位点,下游引入SalⅠ酶切位点及终止密码子TAG,以pET22b(+)Tβ4①为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后克隆入pET22b(+)Tβ4①中, BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定并测序,命名为pET22