重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测.doc

重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测.doc重组人胸腺素B4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测【摘耍】0的:利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素04(TP4):使用大肠杆菌偏爱密码子合***TB4全长基1大I,构建了TB4的二串联体基因(T134②),将其克隆入表达载体pEF22b(+)>|«,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IP1G诱导表达后,经盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白,:获得了纯化的重组TB4②蛋白,:成功构建、表达和纯化了TB4②,为其功能研究奠定基础.【关键词】胸腺索B4串联重复序列克隆分子基因表达0引言胸腺索B4(thymosinbeta4,TB4)广泛分布于各组织、器官和细胞中,与免疫功能、神经发育和肌动蛋白功能密切,还可抗炎,促进血管生成[门、创伤愈合[2]、毛囊发育[3],修复受损的心肌[4]•虽然TI34有着广泛的应用前景,但由于其分子太小,,价格昂贵,,构建了TB4的二串联休基因(TB4②)表达载体,在大肠杆菌中成功地表达和纯化了该串联体,(+),大肠杆菌DH5a及BL21(DE3)由本中心保存;人TB4全长基因、测序(北京奥科生物技术有限责任公司);引物(上海英峻生物公司);限制性内切酶NdeI,BamHI,SalI,14DNA连接酶以及DNAMarkerDL2000(laKaRa);laqPCRMix(天根生化科技有限公司);B型质粒小量提取试剂盒,小分子量DN***段高效快速回收试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司);蛋白分子质量标准(Fermentas);兔抗人TB4多克隆抗体(Abeam,ab14334);HRP山羊抗兔IgG’DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司);IPT3,琼脂,琼脂糖,MTK北京鼎国生物技术有限责任公司);PhenylSepharose6F^stRow(highsub),QSepharoseFastRow,KIAPurifier(Pharmacia);ConA(华美生物工程公司),小鼠淋巴细胞分离液(天津颇洋生物制品科技有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),RPMI1640(Gibco),TP4化学合成品(Pro^ecbny),其他试剂均为国产分析纯;BALB^c小鼠,雄性,6~8周龄(第四军医大学实验动物中心).②基因的克隆按照大肠杆菌惯用密码了及人胸腺素B4氨基酸序列设计并合成了编码T04的全基因片段,5’和3’末端分别带有NdeI和BamHI酶切位点,将其克隆入pET22b(+)中,NdeI和BamHI双酶切鉴定后,将其命名为pET22b(+)TP4①;合成两条引物,上游引入BamHI酶切位点,下游引入SalI酶切位点及终止密码子TAG,以pET22b(+)T04①为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamHI和SalI双卿切后克隆入pET22b(+)TB4①中,BamHI和Sall双酶切鉴定并测序,命名为pET22b(+)TP4②.