重组人胸腺素β4基因克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测.doc

重组人胸腺素β4基因克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测.doc重组人胸腺素B4基因克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测【摘要】目的:利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素04(TB4):使用大肠杆菌偏爱密码子合***TP4全长基因,构建了TP4的二串联体基因(TR4②),将其克隆入表达载体pET22b(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达后,经盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白,:获得了纯化的重组T(34②蛋白,:成功构建、表达和纯化了Tp4②,【关键词】胸腺素34串联重复序列克隆分子基因表0引言胸腺素P4(thymosinbeta4,邛4)广泛分布于各组织、器官和细胞中,与免疫功能、神经发育和肌动蛋白功能密切,还可抗炎,促进血管生成[1].创伤愈合[2L毛囊发育[3],修复受损的心肌[4].虽然邛4有着广泛的应用前景,但实验室及临床试验的TP4主要为化学合成品,价格昂贵,,构建了Tp4由于其分子太小,(Tp4②)表达载体,在大肠杆菌中成功地表达和纯化了该串联体,(+),大肠杆菌DH5a及BL21(DE3)由本中心保存;人TR4全长基因、测序(北京奥科生物技术有限责任公司);引物(上海英峻生物公司);限制性内切酶Ndel,BamHI,Sall,T4DNA连接酶以及DNAMarkerDL2000(TaKaRa);TaqPCRMix(天根生化科技有限公司);B型质粒小量提取试剂盒,小分子量DN***段高效快速收试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司);蛋白分子质量标准(Fermentas);兔抗人邛4多克隆抗体(Abeam,ab14334);HRP山羊抗兔lgG,DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司);IPTG,琼脂,琼脂糖,MTT(北京鼎国生物技术有限责任公司);PhenylSepharose6FastFlow(highsub),QSepharoseFastFlow,KTAPurifier(Pharmacia);ConA(华美生物工程公司),小鼠淋巴细胞分离液(天津澈洋生物制品科技有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),RPMI1640(Gibco),邛4化学合成品(ProSpecTany),其他试剂均为国产分析纯:BALB/c小鼠,雄性,6〜8周龄(第四军医大学实验动物中心).①中,②基因的克隆按照大肠杆菌惯用密码子及人胸腺素P4氨基酸序列设计并合成了编码Tp4的全基因片段,5,和3,末端分别带有Ndel和BamHI酶切位点,将其克隆入pET22b(+)中,Ndel和BamHI双酶切鉴定后,将其命名为pET22b(+)邛4①;合成两条引物,上游引入BamHI酶切位点,下游引入Sall酶切位点及终止密码子TAG,以pET22b(+)T04①为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamHI和Sall双酶切后克隆入pET22b(+)BamHI和Sall双酶切鉴定并测序,pET22b(+)邛4②.毕业论文122重组TR4②的表达重组质粒pET22b(+)T(34②转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,挑取阳性克隆接种于含氨节青霉素100mg/L的LB培养液中,379震荡培养过夜,⑻以1:100分别转接入六个试管中,继续培养2h(A600nm=)后,其中一管作为诱导的阴性对照,,,,,1mmol/LIPTG,继续培养4h,离心收集菌体行SDSPAGE;(b)以1:100分别转接入两个试管中,继续培养2h(A600nm=0・5)后,其中一管作为诱导的阴性对照,,②的WesternBlot鉴定IPTG诱导及未诱导的BL21/pET22b(+)邛4②行SDSPAGE,随后将其转移到NC膜上,用兔抗人TP4多克隆抗体作为一抗,HRP山羊抗兔IgG作为二抗,(34②,诱导BL21/pET22b(+)TR4②4h后收集菌体,超声裂菌后的上清经硫酸鞍盐析、PhenylSepharose6FastFlow(highsub)