重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测..doc

重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测    【摘要】 目的:利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素β4(Tβ4):使用大肠杆菌偏爱密码子合***Tβ4全长基因,构建了Tβ4的二串联体基因(Tβ4②),将其克隆入表达载体pET??22b(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达后,经盐析、疏水层析和离子交换层析纯化重组蛋白,:获得了纯化的重组Tβ4②蛋白,:成功构建、表达和纯化了Tβ4②,为其功能研究奠定基础.【关键词】 胸腺素β4串联重复序列克隆分子基因表达   0引言   胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)广泛分布于各组织、器官和细胞中,与免疫功能、神经发育和肌动蛋白功能密切,还可抗炎,促进血管生成[1]、创伤愈合[2]、毛囊发育[3],修复受损的心肌[4].虽然Tβ4有着广泛的应用前景,但由于其分子太小,,价格昂贵,,构建了Tβ4的二串联体基因(Tβ4②)表达载体,在大肠杆菌中成功地表达和纯化了该串联体,为进一步的研究奠定了基础.   1材料和方法   ??22b(+),大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)由本中心保存;人Tβ4全长基因、测序(北京奥科生物技术有限责任公司);引物(上海英峻生物公司);限制性内切酶NdeⅠ,BamHⅠ,SalⅠ,T4DNA连接酶以及DNAMarkerDL2000(TaKaRa);TaqPCRMix(天根生化科技有限公司);B型质粒小量提取试剂盒,小分子量DN***段高效快速回收试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司);蛋白分子质量标准(Fermentas);兔抗人Tβ4多克隆抗体(Abcam,ab14334);HRP?采窖蚩雇?IgG,DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司);IPTG,琼脂,琼脂糖,MTT(北京鼎国生物技术有限责任公司);PhenylSepharose6FastFlow(highsub),QSepharoseFastFlow,?FKTAPurifier(Pharmacia);ConA(华美生物工程公司),小鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),RPMI1640(Gibco),Tβ4化学合成品(ProSpec??Tany),其他试剂均为国产分析纯;BALB/c小鼠,雄性,6~8周龄(第四军医大学实验动物中心).      ②基因的克隆按照大肠杆菌惯用密码子及人胸腺素β4氨基酸序列设计并合成了编码Tβ4的全基因片段,5′和3′末端分别带有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点,将其克隆入pET??22b(+)中,NdeⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后,将其命名为pET??22b(+)??Tβ4①;合成两条引物,上游引入BamHⅠ酶切位点,下游引入SalⅠ酶切位点及终止密码子TAG,以pET??22b(+)??Tβ4①为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后克隆入pET??22b(+)??