实验一 还原糖和总糖的测定-3,5-二硝基水杨酸比色法.doc

一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,如乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,。三、实验材料、(1000g)(1)具塞玻璃刻度试管:20mL×11(2)滤纸(3)烧杯:100mL×2(4)三角瓶:100mL×1(5)容量瓶:100mL×3(6)刻度吸管:1mL×1;2mL×2;10mL×1(7)恒温水浴锅(8)煤气炉(9)漏斗(10)天平(11)(1)1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:,溶解后移入1000mL容量瓶中,加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL,再加入45g丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000mL。(3)碘-碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾,溶于100mL蒸馏水中。(4)酚酞指示剂:,溶于250mL70%乙醇中。(5)6MHCl和6MNaOH各100mL。(%浓盐酸和24克NaOH定容至100mL)四、,按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。表1葡萄糖标准曲线制作管号1mg/mL葡萄糖标准液(mL)蒸馏水(mL)DNS(mL)葡萄糖含量(mg)光密度值(OD540nm)       将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5min,取出,用冷水迅速冷却至室温,用蒸馏水定容至20mL,加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至540nm,用0号管调零点,等后面7~10号管准备好后,测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,在坐标纸上绘出标准曲线。光密度值葡萄糖标准曲线葡萄糖含量(mg)(1),放入100mL烧杯中,先用少量蒸馏水调成糊状,然后加入50mL蒸馏水,搅