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水中总大肠菌群的测定—多管发酵法

总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气,以及具备革兰氏染色阴性,无芽孢,呈杆状等有关特性,通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数(most probable number),简称MPN表示。

(1)高压蒸气灭菌器。
(2)恒温培养箱、冰箱。
(3)生物显微镜、载玻片。
(4)酒精灯、3mm接种环。
(5)培养皿(直径100mm)、试管(5×150mm),吸管(1、5、10mL)、烧杯(200、500、2000mL)、锥形瓶(500、1000mL)、采样瓶、移液枪。

:将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g***化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中,~,%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀,分装于试管中,于121℃高压灭菌器中灭菌15min,贮存于冷暗处备用。
:按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外,各组份用量增加至三倍。
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①贮备培养基的制备:于2000mL烧杯中,先将20g琼脂加到900mL蒸馏水中,加热溶解。,混合使之溶解,用蒸馏水补充至1000mL,~。趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加入10g乳糖,混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内,于121℃高压灭菌15min,贮于冷暗处备用。
②平皿培养基的制备:将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基的容量,用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液()%美蓝水溶液(),加入已融化的贮备培养基内,并充分混匀(防止产生气泡),立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内,待冷却凝固后,置于冰箱内备用。
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①结晶紫染色液:将20mL结晶紫乙醇饱和溶液(称取4~8g结晶紫溶于100mL95%乙醇中)和80mL 1%草酸铵溶液混合、过滤。该溶液放置过久会产生沉淀,不能再用。
②助染剂:将1g碘与2g碘化钾混合后,加入少许蒸馏水,充分振荡,待完全溶解后,用蒸馏水补充至300mL。此溶液两周内有效。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为易于贮备,可将上述碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中,临用前再加水稀释。
③脱色剂:95%乙醇。
④复染剂:%乙醇中,待完全溶解后,加
90mL蒸馏水。

水源水
①于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管),分别加入10mL水样;于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管),分别加入1mL水样;再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)分别加入1mL 1∶10稀释的水样。共计15管,三个稀释度。将各管充分混匀,置于37℃恒温箱内培养24h。
②平板分离:上述各发酵管经培养24h后,将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基培养基上,置于37℃恒温箱内培养24h,挑选符合下列特征的菌落: