氨基转换作用2009.ppt

实验五氨基转换作用
目的要求:了解转氨酶在代谢过程中的重要作用
学****应用纸层析法鉴定氨基转换反应
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实验原理
体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转换酶的作用下,移换至α-***酸的过程,称氨基转换作用。
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转氨酶(aminotransferase)
转换酶中的一类。催化氨基酸和a-***酸或醛酸之间的氨基转换反应,生成与原来的a-***酸或醛酸相应的a-氨基酸或ω- 氨基酸,原来氨基酸转变成相应的***酸。转氨酶催化的反应都是可逆的
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转氨酶参与氨基酸的分解和合成,是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”;
以谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)最为重要。
GPT 主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中,在肝脏中活力最大。GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。
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本实验是将谷氨酸与***酸在肌肉糜中谷氨酸-***酸氨基转换酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基转化反应,然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。
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谷丙转氨酶
L-谷氨酸
***酸
α-***戊二酸
L-丙氨酸
由于谷氨酸、***酸在肌肉糜中可循其他代谢途径分解和转化,影响氨基转换过程的观察,因此在反应体系中添加溴乙酸以抑制谷氨酸和***酸的其他代谢过程。
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试剂和器材
试剂
1%谷氨酸(中性);1%***酸钠(中性);%KHCO3;% 溴醋酸(中性);2% 醋酸;%标准谷氨酸;%标准丙氨酸。
展开剂:酚饱和水溶液:2份酚加1份水混合放入分液漏斗,振荡。静置24hr后分层,取下层酚置瓶中备用;通风橱里
显色剂:%茚三***正丁醇溶液。
材料

肌肉糜:取兔子肌肉1g,置研钵中,% ***化钠溶液3ml,在低温下研磨成细浆,离心5分钟(3000转/分),弃去沉淀,得肌肉糜提取液。
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操作方法
一、转氨酶作用
1、取试管2只编号(1、2), 1%谷氨酸溶液, 1%***酸溶液, % %溴醋酸, 混匀。,混匀,将其中一试管立即在沸水浴中加热2-3分钟做对照。用试管帽塞住另一只试管
置于45℃水浴中保温40 min。

2. 保温完毕,取出试管。向每只试管中各加2% HAc溶液4滴,再置于沸水浴中2min,使蛋白质完全沉淀。过滤收集滤液或取1毫升在EP管中高速离心1分钟
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二、层析验证
1. 取小培养皿一个,,取圆形滤纸一张,在中心剪一直径1-2mm的小孔,并以圆心约1cm为半径划一圆作为底线。在此底线上,用铅笔点四个等距离的原点并表明1,2,3,4。
1
2
3
4
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用毛细管分别吸取以上两种滤液及标准谷氨酸、标准丙氨酸,依次点在标明号码的原点处,以吹风机吹干,再重新点样2次。注意斑点不能太大,一般直径约2mm为宜。
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